|
|
Katepsin L z klíštěte obecného (Ixodes ricinus)
Talacko, Pavel ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent)
Klíšťata patří mezi významné parazity člověka, kteří přenášejí řadu patogenů. V Evropě je hlavním druhem klíště obecné Ixodes ricinus přenášející bakterii Borrelia burgdorferi (způsobující Lymskou boreliosu) a vir klíšťové encefalitidy. Při trávení proteinů z krve hrají důležitou roli katepsinové proteasy v žaludku klíštěte. Tato práce se zabývá katepsinem L, který je znám jako významná cysteinová trávící proteasa klíšťat. Byl připraven rekombinantní katepsin L z I. ricinus, který byl chromatograficky izolován z kultivačního media expresního systému Pichia pastoris. Izolovaný katepsin L byl charakterizován pomocí N-koncového proteinového sekvenování a pomocí značení fluorescenční aktivitní značkou Green-DCG-04. Analýza substrátové a inhibiční specifity katepsinu L pomocí peptidových substrátů a inhibitorů prokázala Z-FR-AMC jako vhodný substrát s pH optimem 3,5 a Z-FF-DMK jako účinný inhibitor. Byla zjištěna schopnost katepsinu L degradovat proteinové substráty HSA a hemoglobin v silně kyselém prostředí (pH 3,5-4,5). Proteolytická aktivita se stejnými charakteristikami jako byly určeny u rekombinantního katepsinu L byla identifikována v extraktu ze slinných žláz a ve slinách klíštěte I. ricinus. Jde o první nález katepsinové proteasy ve slinách klíšťat. Lze předpokládat, že katepsin L sekretovaný...
|
|
|
Katepsin L z klíštěte obecného: analýza proteolytické aktivity a její regulace
Talacko, Pavel ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Klíště obecné (Ixodes ricinus) je parazit sající krev, jehož význam spočívá v přenosu patogenů způsobujících klíšťovou encefalitidu nebo lymskou boreliosu. Při trávení proteinů z krve hostitele hrají důležitou roli katepsinové proteasy. Tyto proteiny jsou zajímavé jako antigeny pro vývoj protiklíštěcích vakcín. Tato práce se zabývá katepsinem L z klíštěte obecného, konkrétně isoenzymy IrCL1 a IrCL3. IrCL1 byl exprimován v kvasinkách Pichia pastoris a chromatograficky purifikován z expresního media. Byla určena substrátová specifita IrCL1 pomocí štěpení (a) peptidových fluorogenních substrátů, (b) proteinových substrátů analyzovaných hmotnostní spektrometrií. Proteolytická aktivita IrCL1 byla modulována interakcí s glykosaminoglykany, která ovlivňuje aktivitní pH optimum. Dále byl připraven proteolyticky aktivní mutant IrCL1 s redukovaným počtem N-vázaných oligosacharidů vhodný pro krystalizační experimenty. IrCL3 byl exprimován v Escherichia coli, refoldován a aktivován do funkční formy. Proteolytická aktivita IrCL3 v řadě aspektů připomíná IrCL1 včetně substrátové specifity, kyselého pH optima a modulační interakce s glykosaminoglykany. Klíčová slova: cysteinové proteasy, katepsin L, klíště Ixodes ricinus, substrátová specifita, proteolytická aktivita
|
|
|
Katepsin L z klíštěte obecného (Ixodes ricinus)
Talacko, Pavel ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce)
Klíšťata patří mezi významné parazity člověka, kteří přenášejí řadu patogenů. V Evropě je hlavním druhem klíště obecné Ixodes ricinus přenášející bakterii Borrelia burgdorferi (způsobující Lymskou boreliosu) a vir klíšťové encefalitidy. Při trávení proteinů z krve hrají důležitou roli katepsinové proteasy v žaludku klíštěte. Tato práce se zabývá katepsinem L, který je znám jako významná cysteinová trávící proteasa klíšťat. Byl připraven rekombinantní katepsin L z I. ricinus, který byl chromatograficky izolován z kultivačního media expresního systému Pichia pastoris. Izolovaný katepsin L byl charakterizován pomocí N-koncového proteinového sekvenování a pomocí značení fluorescenční aktivitní značkou Green-DCG-04. Analýza substrátové a inhibiční specifity katepsinu L pomocí peptidových substrátů a inhibitorů prokázala Z-FR-AMC jako vhodný substrát s pH optimem 3,5 a Z-FF-DMK jako účinný inhibitor. Byla zjištěna schopnost katepsinu L degradovat proteinové substráty HSA a hemoglobin v silně kyselém prostředí (pH 3,5-4,5). Proteolytická aktivita se stejnými charakteristikami jako byly určeny u rekombinantního katepsinu L byla identifikována v extraktu ze slinných žláz a ve slinách klíštěte I. ricinus. Jde o první nález katepsinové proteasy ve slinách klíšťat. Lze předpokládat, že katepsin L sekretovaný...
|
host ::
RSS.