|
|
Izolace a purifikace nukleových kyselin pomocí magnetizovatelných mikro- a nanočástic
Dostálová, Simona ; Adam, Vojtěch (oponent) ; Kizek, René (vedoucí práce)
Nukleové kyseliny jsou zcela jedinečnou složkou každého organismu. Určují jeho vzhled, chování nebo například dispozice k různým chorobám. I přes jejich důležitost je stále mnoho informací, které o nukleových kyselinách nejsou známy. Pro zkoumání nukleových kyselin je nutné je očistit od všech ostatních složek organismu. Běžné metody izolace a purifikace nukleových kyselin jsou ale často pracné a časově náročné, proto se nově vyvíjejí postupy využívající magnetickou separaci. Bakalářská práce se zabývá magnetizovatelnými mikro- a nanočásticemi a jejich využitím právě v oblasti izolace a purifikace nukleových kyselin. V práci jsou shrnuty obecné podmínky této izolace a jsou zde uvedeny metody detekce nukleových kyselin se zaměřením na elektrochemické metody. Je prezentován vhodný postup pro izolaci a purifikaci nukleových kyselin využívající magnetizovatelné částice a detekci pomocí square-wave voltametrie. V praktické části bakalářské práce byl tento postup optimalizován pro dosažení maximální výtěžnosti. Optimalizovány byly kroky promývání, imobilizace a eluce. Bylo zjištěno, že pro promytí částic před imobilizací nukleových kyselin na jejich povrch byl vhodným roztokem fosfátový pufr. Imobilizace probíhala po dobu 5 minut při teplotě 20 °C a mikrozkumavka během ní byla intenzivně třepána. Imobilizační roztok byl složen z 0,1M Na2HPO4 + 0,1M NaH2PO4, 0,6M guanidium thiokyanátu, 0,15M Tris-HCl o pH 7,5 a 2,5M CsCl. Pro promytí komplexu částice-nukleová kyselina po imobilizaci bylo vhodné použití 5M NaCl. Eluce probíhala po dobu 15 minut při teplotě 99 °C a optimálním elučním roztokem byl Tris-EDTA o pH 9,1.
|
|
|
Analýza aDNA ze zubů a kosterního materiálu s využitím miniSTR lokusů.
Kvítková, Dana ; Brouček, Jaroslav (vedoucí práce) ; Dobisíková, Miluše (oponent)
Během uplynulých dvaceti let došlo v oblasti analýzy DNA z historického materiálu k nesmírnému pokroku. Tato analýza se vzhledem k možnostem zachování jednotlivých tkání provádí především ze vzorků získaných z kostí a zubů. Výjimečně je možná analýza měkké mumifikované tkáně. Limitujícími faktory těchto analýz je vysoký stupeň degradace a malé množství DNA izolované z tohoto materiálu. První výzkumy byly zaměřeny pouze na krátké úseky především mitochondriální DNA. Dnes je již možná analýza celých mitochondriálních genomů současných i vyhynulých druhů živočichů. V případě analýz prováděných z lidských ostatků jsou mnohem cennější úseky jaderné DNA, které nám mohou pomoci určit pohlaví jedince, ale i možné příbuzenské vztahy jedinců pocházejících například z jednoho hrobu. Zásadním krokem celé analýzy DNA je její extrakce z buněk. V každé laboratoři, kde se pracuje s historickou DNA, využívají pravděpodobně jinak modifikovaný extrakční protokol. Hlavním požadavkem na extrakční metody je to, aby poskytovaly DNA v takovém množství a čistotě, aby mohla být využita během dalších kroků analýzy. Vzhledem k vysoké fragmentaci DNA je nutné tomuto faktu přizpůsobit všechny kroky analýzy - především její izolaci a amplifikaci. V neposlední řadě je důležité během práce (nejen) s historickou DNA dodržovat...
|
|
|
Analýza aDNA ze zubů a kosterního materiálu s využitím miniSTR lokusů.
Kvítková, Dana ; Brouček, Jaroslav (vedoucí práce) ; Dobisíková, Miluše (oponent)
Během uplynulých dvaceti let došlo v oblasti analýzy DNA z historického materiálu k nesmírnému pokroku. Tato analýza se vzhledem k možnostem zachování jednotlivých tkání provádí především ze vzorků získaných z kostí a zubů. Výjimečně je možná analýza měkké mumifikované tkáně. Limitujícími faktory těchto analýz je vysoký stupeň degradace a malé množství DNA izolované z tohoto materiálu. První výzkumy byly zaměřeny pouze na krátké úseky především mitochondriální DNA. Dnes je již možná analýza celých mitochondriálních genomů současných i vyhynulých druhů živočichů. V případě analýz prováděných z lidských ostatků jsou mnohem cennější úseky jaderné DNA, které nám mohou pomoci určit pohlaví jedince, ale i možné příbuzenské vztahy jedinců pocházejících například z jednoho hrobu. Zásadním krokem celé analýzy DNA je její extrakce z buněk. V každé laboratoři, kde se pracuje s historickou DNA, využívají pravděpodobně jinak modifikovaný extrakční protokol. Hlavním požadavkem na extrakční metody je to, aby poskytovaly DNA v takovém množství a čistotě, aby mohla být využita během dalších kroků analýzy. Vzhledem k vysoké fragmentaci DNA je nutné tomuto faktu přizpůsobit všechny kroky analýzy - především její izolaci a amplifikaci. V neposlední řadě je důležité během práce (nejen) s historickou DNA dodržovat...
|
|
|
Izolace a purifikace nukleových kyselin pomocí magnetizovatelných mikro- a nanočástic
Dostálová, Simona ; Adam, Vojtěch (oponent) ; Kizek, René (vedoucí práce)
Nukleové kyseliny jsou zcela jedinečnou složkou každého organismu. Určují jeho vzhled, chování nebo například dispozice k různým chorobám. I přes jejich důležitost je stále mnoho informací, které o nukleových kyselinách nejsou známy. Pro zkoumání nukleových kyselin je nutné je očistit od všech ostatních složek organismu. Běžné metody izolace a purifikace nukleových kyselin jsou ale často pracné a časově náročné, proto se nově vyvíjejí postupy využívající magnetickou separaci. Bakalářská práce se zabývá magnetizovatelnými mikro- a nanočásticemi a jejich využitím právě v oblasti izolace a purifikace nukleových kyselin. V práci jsou shrnuty obecné podmínky této izolace a jsou zde uvedeny metody detekce nukleových kyselin se zaměřením na elektrochemické metody. Je prezentován vhodný postup pro izolaci a purifikaci nukleových kyselin využívající magnetizovatelné částice a detekci pomocí square-wave voltametrie. V praktické části bakalářské práce byl tento postup optimalizován pro dosažení maximální výtěžnosti. Optimalizovány byly kroky promývání, imobilizace a eluce. Bylo zjištěno, že pro promytí částic před imobilizací nukleových kyselin na jejich povrch byl vhodným roztokem fosfátový pufr. Imobilizace probíhala po dobu 5 minut při teplotě 20 °C a mikrozkumavka během ní byla intenzivně třepána. Imobilizační roztok byl složen z 0,1M Na2HPO4 + 0,1M NaH2PO4, 0,6M guanidium thiokyanátu, 0,15M Tris-HCl o pH 7,5 a 2,5M CsCl. Pro promytí komplexu částice-nukleová kyselina po imobilizaci bylo vhodné použití 5M NaCl. Eluce probíhala po dobu 15 minut při teplotě 99 °C a optimálním elučním roztokem byl Tris-EDTA o pH 9,1.
|
host ::
RSS.