|
|
Restrikčně-modifikační enzymy Typu I - identifikace pomocí dvourozměrné elektroforesy a studium fosforylace podjednotek Hsd.
Cajthamlová, Kamila
7 1. Úvod Fenomén restrikce a modifikace byl poprvé popsán v 50. letech minulého století. Studium restrikčních enzymů umožňujících manipulaci s molekulami DNA a konstrukci rekombinantních molekul dalo vznik novému směru molekulární biologie - genovému inženýrství. Právě intenzivní studium restrikčních enzymů označovaných dnes jako Typ I umožnilo objev restrikčních endonukleas, které jsou označované jako Typ II a v současné době běžně používané v praxi. V nedávné době došlo v souvislosti s postupujícím sekvenováním bakteriálních genomů, které odhalilo široké rozšíření těchto restrikčních enzymů mezi mikroorganismy v přírodě, k oživení zájmu o restrikční enzymy Typu I. Restrikčně modifikační (R-M) enzymy mají důležitou funkci při ochraně bakteriálních buněk před vstupem cizorodé DNA v procesech konjugace, transfekce a transformace. Proto má studium těchto enzymů i značný praktický význam pro techniky genového inženýrství, neboť efektivnost těchto procesů může být výrazně snížena, jestliže použitá DNA není vhodně modifikována. Tato vlastnost vedoucí k zabránění vstupu cizí nemodifikované DNA do buňky může být naopak využita v boji s fágovou lyzí kmenů producentů. Dále se tyto enzymy zřejmě účastní široké škály molekulárních procesů probíhajících v buňce jako je replikace, genetická rekombinace a reparace DNA....
|
|
|
Restrikčně-modifikační enzymy Typu I - identifikace pomocí dvourozměrné elektroforesy a studium fosforylace podjednotek Hsd.
Cajthamlová, Kamila
7 1. Úvod Fenomén restrikce a modifikace byl poprvé popsán v 50. letech minulého století. Studium restrikčních enzymů umožňujících manipulaci s molekulami DNA a konstrukci rekombinantních molekul dalo vznik novému směru molekulární biologie - genovému inženýrství. Právě intenzivní studium restrikčních enzymů označovaných dnes jako Typ I umožnilo objev restrikčních endonukleas, které jsou označované jako Typ II a v současné době běžně používané v praxi. V nedávné době došlo v souvislosti s postupujícím sekvenováním bakteriálních genomů, které odhalilo široké rozšíření těchto restrikčních enzymů mezi mikroorganismy v přírodě, k oživení zájmu o restrikční enzymy Typu I. Restrikčně modifikační (R-M) enzymy mají důležitou funkci při ochraně bakteriálních buněk před vstupem cizorodé DNA v procesech konjugace, transfekce a transformace. Proto má studium těchto enzymů i značný praktický význam pro techniky genového inženýrství, neboť efektivnost těchto procesů může být výrazně snížena, jestliže použitá DNA není vhodně modifikována. Tato vlastnost vedoucí k zabránění vstupu cizí nemodifikované DNA do buňky může být naopak využita v boji s fágovou lyzí kmenů producentů. Dále se tyto enzymy zřejmě účastní široké škály molekulárních procesů probíhajících v buňce jako je replikace, genetická rekombinace a reparace DNA....
|
|
|
Restrikčně-modifikační enzymy Typu I - identifikace pomocí dvourozměrné elektroforesy a studium fosforylace podjednotek Hsd.
Cajthamlová, Kamila ; Weiserová, Marie (vedoucí práce) ; Janeček, Jiří (oponent) ; Pospíšek, Martin (oponent)
107 7. Závěr 1. Vytvořili jsme podmínky pro dělení a identifikaci všech tří podjednotek Hsd R-M enzymů Typu I EcoKI a EcoR124I na dvourozměrném gelu. Optimalizovali jsme podmínky dělení těchto enzymů v nerovnovážném gradientu pH (NEPHGE) v prvním rozměru 2D-PAGE na pozadí celkových proteinů buněčného extraktu. Tento systém nám v budoucnu umožní provést detailnější studie exprese a postranslační modifikace R-M enzymů Typu I v závislosti na různých fyziologických podmínkách a v souvislosti celkové buněčné proteinové exprese. 2. Využití tohoto systému v primárních pokusech odhalilo existenci dvou isoforem podjednotky HsdR systému EcoKI lišících se velikostí náboje. Usoudili jsme, že jedna z těchto isoforem by mohla být posttranslačně modifikována. 3. Sledování fosforylace zástupců tří skupin R-M enzymů Typu I EcoKI (skupina IA), EcoAI (skupina IB) a EcoR124I (skupina IC), na základě imunoprecipitačních analys kmenů E. coli produkujících tyto enzymy, prokázalo fosforylaci enzymu EcoKI na podjednotce HsdR. Podjednotky HsdM ani HsdS enzymu EcoKI fosforylovány nejsou. Žádná z podjednotek Hsd systémů EcoAI a EcoR124I také fosforylována nebyla. 4. Podjednotka HsdR enzymu EcoKI je fosforylována in vivo pokud je součástí komplexní REasy EcoKI. Samotná HsdR, bez současné exprese HsdM a HsdS, kdy se netvoří funkční...
|
|
| |
host ::
RSS.