|
|
Mechanizmy aktivace a modulace vaniloidních TRP receptorů
Boukalová, Štěpána ; Vlachová, Viktorie (vedoucí práce) ; Hock, Miroslav (oponent) ; Zemková, Hana (oponent)
Štěpána Boukalová Mechanizmy aktivace a modulace vaniloidních TRP receptorů TRPV1 a TRPV3 receptory jsou teplocitlivé iontové kanály patřící do rodiny vaniloidních TRP receptorů. TRPV1 receptor, jenž je specificky exprimován v nociceptivních neuronech, představuje klíčovou molekulu v transdukční dráze bolestivých podnětů, včetně nociceptivního tepla. Význam TRPV3 receptorů ve vnímání tepelných podnětů je prozatím sporný, dobře prokázaná je však jeho úloha v regulaci proliferace a diferenciace keratinocytů. TRP receptory, podobně jako napěťově ovládané draslíkové kanály (Kv), jsou tvořeny čtyřmi podjednotkami, jež každá obsahuje šest transmembránových segmentů (S1-S6). V první části své dizertační práce jsem se zaměřila na úlohu S1 transmembránové oblasti ve funkčních vlastnostech TRPV1 receptoru. Z našich výsledků vyplývá, že část S1 směřující do extracelulárního prostředí hraje významnou úlohu ve vrátkování iontového kanálu. Konzervativní mutace kladně nabitého rezidua v dané oblasti (R455K mutace) vedla ke vzniku TRPV1 iontových kanálů se zvýšenou aktivitou, jež však nebyly citlivé ke stimulačnímu působení sníženého pH prostředí. Naopak, zvýšená koncentrace protonů v extracelulárním prostředí vedla ke stabilizaci zavřeného stavu mutantního iontového kanálu. Velmi podobné fenotypické vlastnosti jako u...
|
|
|
Modulace synaptického přenosu, studium na míšních řezech in vitro
Mrózková, Petra ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Modulace synaptického přenosu v zadním rohu míšním hraje klíčovou úlohu v nociceptivní signalizaci, zejména za patologických bolestivých stavů. Cílem naší práce bylo rozvinout metodu calcium imagingu na míšních řezech in vitro. Tato metoda umožňuje sledovat změny intracelulární koncentrace volných vápenatých iontů (iCa2+ ), které jsou hlavním mediátorem neuronální plasticity. V naší práci jsme se soustředili na použití této metody na konvenčním fluorescenčním mikroskopu a na studium vlivu aplikace látek ovlivňujících synaptický přenos. V experimentech byly snímány koncentrační změny iCa2+ v 744 neuronech zadních rohů míšních (lamina I a II) po elektrické stimulaci zadních kořenů. V první sérii experimentů byly použity stimulační protokoly preferenčně aktivující A a A+C vlákna zadních kořenů a ověřena dlouhodobá stabilita vápníkových odpovědí. Stimulace zadního kořene vyvolala ve sledovaných neuronech rychlý a pozdní typ vápníkové odpovědi. Aplikace antagonistů glutamátových receptorů AMPA a NMDA typu, CNQX (50µM) a MK801 (45µM) snížila podle očekávání amplitudu vápníkové odpovědi oproti kontrolním hodnotám a potvrdila jejich jednoznačný význam pro synaptickou aktivaci. V několika pokusech jsme zkoumali účinek kapsaicinu, známého agonisty TRPV1 receptorů. Aplikace i nízké koncentrace kapsaicinu...
|
|
|
Stavy patologické bolesti, úloha modulace míšního synaptického přenosu
Nerandžič, Vladimír ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Modulace synaptického přenosu v zadním rohu míšním hraje klíčovou úlohu v nociceptivní signalizaci. Studie z poslední doby naznačují velký význam míšních presynaptických TRPV1 (transient receptor potential vanilloid) receptorů, které na periferii působí jako integrátory nociceptivních podnětů. Mechanismy jejich aktivace a jejich vliv na modulaci synaptického přenosu ale nejsou dosud zcela známy. Předchozí studie také ukázaly vliv řady mediátorů zánětu a cytokinů na funkci TRPV1 receptorů. Cílem naší studie bylo proto ukázat, jak se mění aktivace presynaptických TRPV1 receptorů v míše po aplikaci endogenního agonisty N-oleoyldopaminu (OLDA) u modelu periferní neuropatie, po inkubaci s cytokinemTNFα a jaký je účinek prekurzoru anandamidu N-acylfosfatidylethanolaminu (NAPE). V experimentech byly snímány miniaturní excitační postsynaptické proudy (mEPSC) na neuronech akutních míšních řezů metodou patch clamp. V první sérii experimentů byla testována citlivost na aplikaci endogenního agonisty OLDA 5 dnů po navození modelu periferní neuropatie. Aplikace již nízké koncentrace OLDA (0,2 μM) výrazně zvýšila frekvenci mEPSC na 250 % kontrolní hodnoty, na rozdíl od snímání u kontrolních experimentů kde je ke zvýšení potřeba vysoké koncentrace OLDA (10 μM). Inkubace řezů s TNFα ve druhé řadě pokusů u stejného...
|
|
|
Structural and Functional Study on Transient Receptor Potential Vanilloid 1 (TRPV1) and Ankyrin Receptor (TRPA1) Channels
SAMAD, Abdul
Investigations of structural and functional relationships of rat transient receptor potential cation channel, subfamily V, member 1 (TRPV1), also known as the capsaicin receptor, and human transient receptor potential cation channel, subfamily A, member 1, also known as TRPA1, are presented. Capsaicin induced Ca2+ -dependent desensitization of rat TRPV1 channel is studied and lead to the identification of key amino acid residues in the C- terminal domain of TRPV1 interacting with the membrane phospholipid PIP2 and an intradomain interaction that controls the open and desensitized state of the TRPV1 channel. Further the molecular basis of agonist AITC- and voltage-dependent gating on TRPA1 is explained. Hereby, residue P949 located near the center of the sixth transmembrane spanning helix (S6) is structurally required for normal functioning of the receptor and the distal bi-glycine G958XXXG962 motif controls its activation/deactivation properties. Furthermore, the gating region is extended towards the cytoplasmic part of the channel, putatively located near the inner mouth of the channel pore. A following series of experiments lead to the identification of a limited number of residues that appear important for allosteric regulation of the channel by chemical and voltage stimuli (K969, R975, K989, K1009, K1046, K1071, K1092 and K1099). In addition, three charge-neutralizing `gain-of- function{\crq} mutants (R975A, K988A, and K989A) which exhibited higher sensitivity to depolarizing voltages were characterized, indicating that these residues are directly involved in voltage-dependent modulation of TRPA1.
|
host ::
RSS.