|
|
Charakterizace rekombinantních cathepsinů B ptačí schistosomy Trichobilharzia regenti
Dvořáková, Hana ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Dvořák, Jan (oponent)
Tato studie se zabývá rekombinantními cysteinovými peptidázami - cathepsiny B - původem z ptačí schistosomy Trichobilharzia regenti, která je jedinečná v rámci celé čeledě pro svoji schopnost migrovat nervovou tkání až do míst konečné lokalizace. Peptidázy napomáhají invazi tohoto parazita do hostitele, migraci ve tkáni, degradaci hostitelských proteinů a pravděpodobně také úniku před hostitelským imunitním systémem. Tato práce navazuje na výzkum prováděný pracovníky Katedry parazitologie Přírodovědecké fakulty Karlovy Univerzity a měla za cíl prohloubit charakteristiku rekombinantních cathepsinů B původem z T. regenti. U T. regenti byly již dříve charakterizovány 2 cysteinové peptidázy cathepsin B1 (TrCB1) a cathepsin B2 (TrCB2). TrCB1 je lokalizován ve střevě schistosomul a je pravděpodobně zodpovědný za trávení. TrCB2 byl nalezen v postacetabulárních žlázách cerkárií a zřejmě napomáhá při penetraci. Rekombinantní pro-cathepsiny B (izoformy TrCB1.1 a TrCB1.4 a dále TrCB2) byly získány expresí v systému P. pastoris. Byl rovněž proveden pokus o produkci rekombinantní izoformy TrCB1.6, jehož cystein aktivního místa je nahrazen glycinem, v kvasinkovém systému Pichia pastoris. Zatímco TrCB2 byl schopen se sám aktivovat za podmínek expresního media, TrCB1.1 a TrC1.4 zymogeny byly efektivně aktivovány...
|
|
|
Glykosylace a antigenní vlastnosti proteinů ze slin flebotomů Phlebotomus perniciosus a P. orientalis
Sumová, Petra ; Volf, Petr (vedoucí práce) ; Grubhoffer, Libor (oponent)
Cílem této práce bylo zmapovat glykosylaci a antigenní vlastnosti slinných proteinů dvou druhů flebotomů, Phlebotomus perniciosus a P. orientalis, kteří jsou významnými vektory viscerální leishmaniózy. Pomocí afinoblotu se značenými lektiny jsme prokázali, že řada slinných proteinů obou studovaných druhů flebotomů je N-glykosylována, přítomnost O-glykosylací nebylo možné potvrdit. Úroveň N-glykosylace většiny těchto proteinů je poměrně nízká, větší množství potenciálních N-glykosylačních míst bylo nalezeno pouze v aminokyselinových sekvencích hyaluronidázy P. orientalis a endonukleáz obou testovaných druhů. Pro expresi v bakteriálním expresním systému byly vybrány čtyři slinné antigenní proteiny P. perniciosus, z nichž dva proteiny (PpeSP01 a PpeSP01B) nebyly glykosylovány a úroveň glykosylace zbylých dvou proteinů (PpeSP03B a PpeSP07) byla nízká. Antigenní vlastnosti čtyř vybraných rekombinantních proteinů P. perniciosus byly následně testovány prostřednictvím imunoblotu a ELISA testů. Během počátečních pokusů se séry experimentálně exponovaných psů se dva proteiny (rSP07 a rSP01B) ukázaly jako nevhodné a byly tudíž z dalších experimentů vyřazeny. Rekombinantní proteiny rSP03B a rSP01 byly rozeznávány stejnými IgG protilátkami jako nativní formy těchto proteinů ze slinných žláz P. perniciosus....
|
|
|
Inhibitory Kunitzova typu u Eudiplozoon nipponicum
Černíková, Markéta ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Jedličková, Lucie (oponent)
Proteiny obsahující Kunitz domény jsou nejčastěji inhibitory serinových proteáz. Jejich obecnou charakteristikou je přítomnost tří disulfidových vazeb a relativně malá velikost kolem 6-10 kDa, ale nezřídka se objevují velké proteiny s několika Kunitz doménami nebo jsou tyto domény součástí komplexnějších proteinů. Jejich funkce obvykle souvisí s regulací fyziologických a proteolytických procesů, ale i s interakcí s patogeny nebo jinými obrannými mechanismy, např. jako součást hlenu sasanek nebo jedu hadů a jiných bezobratlých živočichů. Zaměřili jsme se na Kunitz proteiny u Eudiplozoon nipponicum, parazita třídy Monogenea ze žaber kapra obecného (Cyprinus carpio). V transkriptomu tohoto parazita bylo identifikováno na základě podobnosti s již popsaným Kunitz proteinem EnKT1 několik dalších podobných sekvencí, z čehož lze usuzovat, že tento parazit využívá pro svou specifickou potravní strategii, podobně jako i jiní krevsající paraziti, celou sadu inhibitorů serinových proteáz s různými konkrétními funkcemi. Pomocí PCR bylo několik sekvencí s Kunitz doménou nalezených v transkriptomu ověřováno a případně doplněno pomocí RACE-PCR. Jeden protein, nazvaný EnKC1, byl následně produkován rekombinantně expresí v buňkách bakterie E. coli kmenů SHuffleTM a Rosetta Gami B. U rekombinantního proteinu s Kunitz...
|
|
|
Interaction of a surface marker of immune cells with low-molecular weight ligands and their polymer conjugates
Šimonová, Lenka ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Každý rok zemřou na rakovinu miliony lidí po celém světě. V posledním desetiletí nabízí imunoterapie nové léčebné přístupy s dlouhotrvajícími remisemi u řady pa- cientů. Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (Food and Drug Administration, FDA) schválil několik nových léčiv založených na imunoterapii. Nicméně, pro většinu pacientů je tato léčba neúčinná, případně se nemoc brzy znovu projeví. Slibně se dnes jeví hledání a zkoumání nových kontrolních bodů imunitního systému a léčba kombinující cílení různých těchto bodů. Tato práce se zaměřuje na nový cíl imunoterapie - CD73. CD73 je membránová ektonukleotidasa, vysoce exprimovaná v regulačních leukocytech a v rakoviných buňkách. Svojí enzymatickou aktivitou, tvorbou imunosupresivního adenosinu, přispívá k vytváření nádorového mikroprostředí. Tento nový kontrolní bod imu- nitního systému je proto intensivně studován. Cílem této práce je vývoj nových metod cílení a inhibice CD73. Rozpustná forma rekombinantní lidské CD73 (rhCD73) byla připravena v savčím expresním systému, dále byla také připravena buněčná linie stabilně exprimující CD73 na svém povrchu. Inhibitory potřebné pro oba zmíněné cíle byly navrženy na základě struktury publikovaného inhibitoru CD73. Protilátkové mimetikum pro charakterisaci CD73 bylo vyvinuto a evaluováno. Tento HPMA polymerní...
|
|
|
Charakterizace rekombinantní myší glutamátkarboxypeptidasy III
Janoušková, Karolína ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII, PSMA, NAALADasa) je transmembránová metalopeptidasa a díky štěpení specifických substrátů β-citryl-L-glutamátu (BCG), N-acetyl-L-aspartyl-L-glutamátu (NAAG) a polyglutamylovaných folátů (Pte-Glun) je studována jako potenciální terapeutický cíl. Enzymy, které by mohly kompenzovat enzymovou aktivitu a funkce GCPII, jsou proto rovněž relevantními cíli enzymologického výzkumu. Jedním z homologů GCPII s podobnou enzymovou aktivitou je glutamátkarboxypeptidasa III (GCPIII, NAALADasa II). U rekombinantní myší GCPIII ještě nebyly stanoveny kinetické parametry KM a kcat popisující její aktivitu. Myší GCPIII je důležité kineticky charakterizovat a porovnat s lidským ortologem, aby bylo zjištěno, jestli je enzymová aktivita tohoto enzymu v myším modelu srovnatelná se situací u člověka. Rekombinantní myší GCPIII byla kineticky charakterizována. Kinetické parametry rekombinantní myší GCPIII pro substráty NAAG a BCG byly změřeny metodou štěpení radioaktivně značeného substrátu. Kinetika reakce pro substrát Pte-Glu2 byla analyzována pomocí HPLC. Z hlediska štěpení NAAGu je lidská GCPIII účinnější než myší ortolog, v případě substrátu BCG jsou enzymy srovnatelné. Tyto výsledky nás posunou blíže k pochopení role GCPIII v nejpoužívanějším zvířecím modelu. Klíčová slova:...
|
|
|
Interaction of a surface marker of immune cells with low-molecular weight ligands and their polymer conjugates
Šimonová, Lenka ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Každý rok zemřou na rakovinu miliony lidí po celém světě. V posledním desetiletí nabízí imunoterapie nové léčebné přístupy s dlouhotrvajícími remisemi u řady pa- cientů. Úřad pro kontrolu potravin a léčiv (Food and Drug Administration, FDA) schválil několik nových léčiv založených na imunoterapii. Nicméně, pro většinu pacientů je tato léčba neúčinná, případně se nemoc brzy znovu projeví. Slibně se dnes jeví hledání a zkoumání nových kontrolních bodů imunitního systému a léčba kombinující cílení různých těchto bodů. Tato práce se zaměřuje na nový cíl imunoterapie - CD73. CD73 je membránová ektonukleotidasa, vysoce exprimovaná v regulačních leukocytech a v rakoviných buňkách. Svojí enzymatickou aktivitou, tvorbou imunosupresivního adenosinu, přispívá k vytváření nádorového mikroprostředí. Tento nový kontrolní bod imu- nitního systému je proto intensivně studován. Cílem této práce je vývoj nových metod cílení a inhibice CD73. Rozpustná forma rekombinantní lidské CD73 (rhCD73) byla připravena v savčím expresním systému, dále byla také připravena buněčná linie stabilně exprimující CD73 na svém povrchu. Inhibitory potřebné pro oba zmíněné cíle byly navrženy na základě struktury publikovaného inhibitoru CD73. Protilátkové mimetikum pro charakterisaci CD73 bylo vyvinuto a evaluováno. Tento HPMA polymerní...
|
|
|
Development of high-throughput screening assay for the identification of inhibitors targeting influenza A polymerase
Karlukova, Elena ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Virus chřipky způsobuje infekční oněmocnění, postihující 3 až 5 milionů jedinců ročně. V současné době se k lečbě chřipkových infekcí používají dva druhy léčiv: inhibitory neuraminidasy a inhibitory iontového kanálu M2. Vzrůstající počet kmenů resistentních vůči těmto inhibitorům a riziko vzniku nových pandemických kmenů však vytvářejí dosud neuspokojenou potřebu nového typu inhibitorů. RNA-dependentní RNA polymerasa viru chřipky je novým cílem pro vývoj inhibitorů směrovaných proti viru chřipky. Cílem této diplomové práce bylo vyvinout vysokokapacitní testovací metody pro nalezení potenciálních inhibitorů dvou aktivit chřipkové polymerázy - vazby 7-methylguanosinové čepičky hostitelských RNA a jejich enodukleasové štěpění. Pro doménu vázající 7-methylguanosinovou čepičku bylo testování založeno na metodě DIANA (DNA-linked Inhibitor ANtibody Assay), která byla nedávno vyvinuta v laboratoři školitele; testování inhibitorů endonukleasové domény pak bylo založeno na technologii AlphaScreen. Pro potřeby vývoje velkokapacitních testovacích metod byla připravena rekombinantní doména vázající 7-methylguanosinovou čepičku z podjednotky PB2 a N-koncová doména PA podjednotky chřipkové polymerasy, nesoucí endonukleasovou aktivitu. Oba rekombinantní proteiny byly exprimovány s příslušnými afinitními značkami a...
|
|
|
Strukturní charakterizace intracelulární formy myšího Nkr-p1a proteinu.
Vaňková, Pavla ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Kolenko, Petr (oponent)
4 ABSTRAKT NK buňky jsou komponentou přirozeného imunitního systému, která je odvozena od lymfoidního progenitoru. Pomocí sofistikovaného receptorového repertoáru, jež exprimují na svém povrchu, se účastní obrany organismu proti patogenním, virem infikovaným nebo nádorovým buňkám. Současně produkují cytokiny, jejichž prostřednictvím pomáhají spoluutvářet i adaptivní imunitní odpověď. Tato práce je zaměřena na studium struktury rozpustné isoformy myšího receptoru mNkr-p1a, která byla v nedávné době na transkripční úrovni identifikována členem naší laboratoře a nese pracovní označení isoforma 2. Cílem práce bylo vyprodukovat protein mNkr-p1a iso2 v prokaryotickém expresním systému a provést jeho renaturaci a purifikaci in vitro. V další fázi byl získaný produkt analyzován metodami hmotnostní spektrometrie. Jí získané výsledky nás ovšem dovedly k určitým pochybnostem, zda náš protein v roztoku nabývá definovanou 3D strukturu a nejedná se pouze o artefakt. To bylo vyvráceno dalšími biofyzikálními metodami, nukleární magnetickou rezonancí a měřením cirkulárního dichroismu a dynamického rozptylu světla. Klíčová slova: NK buňky Receptor mNkr - p1a Krátká isoforma mNkr - p1a iso2 Alternativní sestřih Biosyntéza proteinů Produkce rekombinantních proteinů Purifikace proteinů Hmotnostní spektrometrie Disulfidové vazby...
|
|
|
Glykosylace a antigenní vlastnosti proteinů ze slin flebotomů Phlebotomus perniciosus a P. orientalis
Sumová, Petra ; Volf, Petr (vedoucí práce) ; Grubhoffer, Libor (oponent)
Cílem této práce bylo zmapovat glykosylaci a antigenní vlastnosti slinných proteinů dvou druhů flebotomů, Phlebotomus perniciosus a P. orientalis, kteří jsou významnými vektory viscerální leishmaniózy. Pomocí afinoblotu se značenými lektiny jsme prokázali, že řada slinných proteinů obou studovaných druhů flebotomů je N-glykosylována, přítomnost O-glykosylací nebylo možné potvrdit. Úroveň N-glykosylace většiny těchto proteinů je poměrně nízká, větší množství potenciálních N-glykosylačních míst bylo nalezeno pouze v aminokyselinových sekvencích hyaluronidázy P. orientalis a endonukleáz obou testovaných druhů. Pro expresi v bakteriálním expresním systému byly vybrány čtyři slinné antigenní proteiny P. perniciosus, z nichž dva proteiny (PpeSP01 a PpeSP01B) nebyly glykosylovány a úroveň glykosylace zbylých dvou proteinů (PpeSP03B a PpeSP07) byla nízká. Antigenní vlastnosti čtyř vybraných rekombinantních proteinů P. perniciosus byly následně testovány prostřednictvím imunoblotu a ELISA testů. Během počátečních pokusů se séry experimentálně exponovaných psů se dva proteiny (rSP07 a rSP01B) ukázaly jako nevhodné a byly tudíž z dalších experimentů vyřazeny. Rekombinantní proteiny rSP03B a rSP01 byly rozeznávány stejnými IgG protilátkami jako nativní formy těchto proteinů ze slinných žláz P. perniciosus....
|
|
|
Molekulární podstata interakce rostlinného HSP90 s mikrotubuly
Benáková, Martina ; Krtková, Jana (vedoucí práce) ; Malcová, Ivana (oponent)
Mikrotubuly (MT) jsou jednou ze základních buněčných struktur a účastní se mnoha klíčových dějů v rostlinných buňkách a jejich vlastnosti a funkce jsou ovlivňovány a modifikovány dalšími proteiny. Tyto proteiny řadíme do skupiny proteinů asociovaných s mikrotubuly (MAPs, microtubule-associated proteins). Jedním z MAP je také mnou zkoumaný molekulární chaperon Hsp90, který zastává v buňce velké množství nejrůznějších funkcí. Mimo jiné u něj byla již v minulosti prokázána kolokalizace s MT (Freudenreich a Nick, 1998; Petrášek et al., 1998). Přímá vazba k MT byla však popsána teprve nedávno, a to za pomoci kosedimentačních reakcí specifické tabákové cytozolické izoformy Hsp90, která byla díky své schopnosti vázat MT nazvána Hsp90_MT. Zároveň bylo zjištěno, že vazba k MT je nezávislá na aktivitě ATP (Krtková et al., 2012). Ve zmíněné práci autoři také zjistili pozitivní vliv Hsp90_MT na obnovu MT vystavených chladovému stresu. Přestože se na dynamice MT cytoskeletu podílí v obrovské míře právě MAP, je s podivem, že u mnohých z nich dosud není známá molekulární podstata interakce s MT, tedy jejich MT-vazebná doména. Rozhodli jsme se proto určit tuto doménu u tabákového Hsp90_MT za pomoci tvorby rekombinantních proteinů obsahujících charakteristické domény pro rodinu Hsp90 a následných kosedimentačních...
|
host ::
RSS.