|
Mechanismus přenosu signálu hemovými senzorovými proteiny detekujícími kyslík
Stráňava, Martin ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Macek, Tomáš (oponent)
CZ Hemové senzorové proteiny, které detekují plynné molekuly, hrají v bakteriální fyziologii důležitou roli v regulaci mnoha procesů jako je např. buněčná diferenciace, virulence, tvorba biofilmu nebo mezibuněčná komunikace. Jejich struktura se vyznačuje typickou modulární architekturou, kde různé senzorové domény (nejčastěji na N-konci) regulují aktivitu katalytických neboli funkčních domén (nejčastěji na C-konci). V této disertační práci jsme se zaměřili na studium tří zástupců ze skupiny senzorových proteinů detekujících kyslík a to histidinkinasy AfGcHK, diguanylátcyklasy YddV, fosfodiesterasy EcDOS a dále na studium proteinu RR, který je interakčním partnerem AfGcHK. Hlavním cílem disertační práce bylo prostudovat intraproteinový/interdoménový přenos signálu u dvou zástupců hemových senzorových proteinů s globinovým uspořádáním senzorové domény (AfGcHK, YddV) a u jednoho zástupce s PAS uspořádáním senzorové domény (EcDOS). Dalším cílem bylo popsat interproteinový přenos signálu u dvousložkového systému AfGcHK-RR a strukturně charakterizovat tyto dva interakční partnery. Důraz byl kladen také na studium interakce modelových senzorových domén s různými signálními molekulami a popis funkce jednotlivých aminokyselin účastnících se vazby těchto signálních molekul. Studiem...
|
|
Studie s cílem odhalit nové zástupce hemových senzorových proteinů
Pašek, Dominik ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Hemoproteiny jsou rozmanitou a velmi významnou skupinou proteinů podílející se na celé řadě biochemických pochodů. Mezi jejich typické role v živých organismech patří uskladňování a distribuce kyslíku, enzymová katalýza redoxních reakcí a transport elektronů v dýchacím řetězci. V relativně nedávné době byla objevena čtvrtá skupina hemoproteinů, tzv. hemové senzorové proteiny. Do této skupiny náleží mimo jiné proteiny, které disponují schopností reversibilně vázat hem, jenž takových případech plní funkci signální molekuly. Tato reversibilní interakce má pro buňky zásadní význam v některých signalizačních drahách. Jak bylo zjištěno, jedním z hemových senzorových proteinů je také významný transkripční faktor, protein p53. První fáze předkládané diplomové práce byla věnována přípravě proteinů rodiny p53 včetně některých jejich delečních mutantů. Následně bylo úkolem u vybraných proteinů prostudovat vliv hemu na jejich oligomerní stav. Zásadní část diplomové práce je tvořena spektrofotometrickými studiemi, které si kladly za cíl odhalit potenciální interakce studovaných proteinů s hemem, popřípadě dané interakce charakterizovat. Klíčová slova: hem, hemové senzorové proteiny, rodina proteinu p53, transkripční faktory, signální transdukce
|
|
Dvousložkový signalizační systém bakterií využívající analogy hemu
Bečková, Alexandra ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Prošková, Veronika (oponent)
5 Abstrakt Hemoproteiny jsou esenciální součástí jak prokaryontních, tak eukaryotních organizmů, kde hrají roli při naplňování mnoha významných životních funkcí. Dle funkce je možné hemoproteiny rozdělit do několika typů. Konkrétní typ proteinů, který byl i objektem zájmu téhle bakalářské práce jsou senzorové hemoproteiny. Funkce části těchto senzorových hemoproteinů spočívá v schopnosti detekce diatomických molekul plynů a jejich následném navázaní na molekulu hemu v daném hemoproteinu, čímž se změní vlastnosti taky senzorového hemoproteinu a následně se signál stává součástí signalizačních drah. Příkladem senzorového hemoproteinu je histidinkinasa s globinovou strukturou senzorové domény z Anaeromyxobacter sp. Fw 109 (AfGcHK), s kterou se během experimentální části bakalářské práce pracovalo. Nejprve byla provedena transformace E. coli BL-21 (DE3) buněk plazmidem pET21c(+)/AfGcHK, následná kultivace buněk a exprese AfGcHK proteinu v buňkách. Exprimovaný AfGcHK protein byl izolován ve dvou formách. Jedna forma představovala AfGcHK protein s obsahem hemu, tedy se zabudovaným železem ve své struktuře. Druhá forma představovala AfGcHK protein s obsahem analogu hemu, který měl ve své struktuře místo železa zabudován nikl. Protein s obsahem hemu byl izolován s výtěžkem 3,98 mg/l TB média a protein s obsahem...
|
|
Hemové senzorové proteiny jako potenciální markery oxidačního a buněčného stresu indukovaného ionizujícím zářením
Vávra, Jakub ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Souček, Pavel (oponent) ; Tichý, Aleš (oponent)
Ionizující záření je jedním z možných induktorů oxidačního stresu v buňce. Důsledkem této patologické situace je vznik reaktivních radikálů, které mohou modifikovat klíčové biomolekuly. V závislosti na dávce způsobuje expozice organismu ionizujícímu záření deterministické (nemoc z ozáření) či stochastické (maligní procesy) účinky. Proto je v případě suspektní expozice organismu ionizujícímu záření nutno rychle a efektivně stanovit jeho dávku. Přesto nebyla dosud vyvinuta účinná, rychlá a zároveň rutinně aplikovatelná metoda pro stanovení dávky pomocí biologických markerů. Cílem předkládané disertační práce je proto prostřednictvím nových poznatků o hemových senzorových proteinech přispět k pochopení mechanismů, jimiž buňky reagují na oxidační stres. Předkládaná disertační práce se zaměřuje na dva eukaryotické proteiny, kinasu HRI (z anglického názvu "heme regulated inhibitor") a transkripční faktor p53. Důraz je kladen na modulaci funkcí a konformačního stavu těchto proteinů prostřednictvím molekuly hemu. Součástí disertační práce je také optimalizace metod klíčových pro splnění jejích hlavních cílů. Konkrétně byla pomocí elektroforézy v prostředí Phos-tagu studována kinasová aktivita přirozené formy HRI a mutantní formy Gly202Ser, jejíž výskyt je asociován s nádory plic. V případě obou forem byl...
|
|
Detailní enzymová charakterizace modelového zástupce hemových kyslíkových senzorů
Vojáčková, Lukrécie Sophie ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Čermáková, Michaela (oponent)
Tato práce je zaměřena na hemové senzorové proteiny detekující kyslík, zejména na fosfodiesterasu z bakterie Escherichia coli, označovanou jako EcDOS. Tento enzym katalyzuje degradaci c-di-GMP, což je důležitá signální molekula bakterií, jež má vliv na určité buněčné pochody, např. na pohyblivost bakterií nebo tvorbu biofilmů. Práce se zabývá detailní enzymovou kinetikou forem proteinu v různých redoxních a ligandových stavech iontu železa hemu [Fe(III), Fe(II) a Fe(II)-O2] a věnuje se také mutantní formě tohoto enzymu (EcDOS H77A), která neváže hem. Jedním z výsledků práce bylo potvrzení toho, že forma EcDOS WT Fe(II)-O2 vykazuje vyšší hodnoty kcat než forma EcDOS s iontem železa hemu v redukovaném stavu. Překvapením bylo zjištění, že aktivita enzymu je ovlivněna nejen stavem iontu železa hemu, ale i přítomnými dvojmocnými kationty kovů a jejich koncentracemi. Přítomnost kationtu kovu je pro funkci enzymu esenciální a vhodnými ionty kovů, které stimulují enzymovou aktivitu, jsou Mg2+ , Mn2+ a Zn2+ nebo jejich směsi, jež působí na aktivitu enzymu za zvolených podmínek synergicky. Analýza pomocí ICP-MS také prokázala, že kationty Zn2+ jsou přirozenou součástí enzymu. Tudíž by pro další kinetické studie bylo vhodné využít Zn2+ nebo směsi iontů kovů, které jsou fyziologické pro E. coli, z níž EcDOS...
|
|
Studium struktury a funkce modelových hemových proteinů
Lengálová, Alžběta ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent) ; Muchová, Lucie (oponent)
Hem je jedním z nejdůležitějších a nejlépe prostudovaných kofaktorů potřebných pro správné fungování mnoha proteinů. Proteiny obsahující hem tvoří obrovskou skupinu biologicky významných molekul, které se účastní mnoha fyziologických procesů. Předkládaná disertační práce se věnuje dvěma skupinám hemových senzorových proteinů, a to prokaryotickým hemovým senzorům plynných molekul a eukaryotickým senzorům detekujících hem. Hemové senzory, které detekují plynné molekuly, hrají důležitou roli v regulaci mnoha bakteriálních procesů a jsou obvykle tvořeny dvěma doménami, doménou senzorovou a doménou funkční. Disertační práce se zaměřuje na studium dvou zástupců ze skupiny bakteriálních senzorů detekujících plyny, histidinkinasy AfGcHK a diguanylátcyklasy YddV. Hlavním cílem práce bylo objasnit mechanismus mezidoménového přenosu signálu u těchto dvou modelových hemových senzorů. Za pomoci rentgenové krystalografie a metody vodík-deuteriové výměny v kombinaci s hmotnostní spektrometrií byly odhaleny významné rozdíly ve struktuře proteinu AfGcHK při přechodu z jeho aktivní na neaktivní formu. Příjem určitého signálu senzorovou doménou AfGcHK ovlivní strukturní vlastnosti proteinu, a tyto konformační změny mají pak nepřímo vliv na enzymovou aktivitu domény funkční. Disertační práce se dále detailněji věnuje...
|
|
Studium vlivu analogů hemu na strukturně-funkční charakteristiku modelového zástupce hemových senzorových proteinů
Ďatko, Peter ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Vávra, Jakub (oponent)
Hemové senzorové proteiny umožňují bakteriálním buňkám reagovat na změnu koncentrace látek v jejich okolí. Tato odpověď závisí na vazbě ligandu na atom železa, koordinovaného v molekule hemu. Modelem tohoto signálního systému je histidinkinasa s globinovou strukturou senzorové domény, AfGcHK. Hlavním cílem této bakalářské práce byla příprava a základní charakterizace formy AfGcHK, která místo hemu obsahuje komplex protoporfyrinu s manganem. Pro expresi proteinu byla využita transformace buněk E. coli BL- 21 (DE3) plamidem pET21c(+)/AfGcHK. Protein byl izolován a purifikován pomocí afinitní chromatografie a gelové chromatografie. Pro zjištění enzymové aktivity byla použita elektroforéza na polyakrylamidovém gelu v prostředí dodecylsíranu sodného s přídavkem Phos-tagu. Bylo zjištěno, že připravená unikátní forma AfGcHK je enzymově aktivní. Dále provedená spektrální analýza prokázala, že forma AfGcHK obsahující komplex protoporfyrinu s manganem je citlivá k redukci dithioničitanem sodným. Klíčová slova: hem, hemové senzorové proteiny, kyslíkový senzor, přenos signálu
|
|
Biochemická charakterizace modelového zástupce hemových senzorových proteinů obsahujícího analog hemu
Hlubučková, Darina ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Prošková, Veronika (oponent)
Nedílnou součástí života buněk je buněčná signalizace, která je zajištěna mimo jiné hemovými proteiny, konkrétně jejich skupinou s názvem hemové senzorové proteiny. Hemové senzorové proteiny se dělí do dvou skupin, hemové senzorové proteiny detekující hem, které se vyskytují spíše v eukaryotních buňkách a hemové senzorové proteiny detekující plynné molekuly, které jsou typické spíše pro prokaryotní buňky. Plynnými molekulami mohou být v tomto případě CO, NO a O2. Skupina hemových senzorových proteinů detekujících kyslík má kruciální význam pro bakterie, které se musí přizpůsobovat proměnlivé koncentraci kyslíku v okolním prostředí. Jednou z těchto bakterií je půdní bakterie Anaeromyxobacter sp., kmen Fw 109-5, která obsahuje hemový senzorový protein s globinovou strukturou senzorové domény a histidinkinasovou aktivitou domény funkční (AfGcHK), umožňující bakteriím kromě jiného například tvorbu biofilmu.. . V rámci teoretické části této práce byly shrnuty dosavadní poznatky o hemových senzorových proteinech se zaměřením na protein AfGcHK. V praktické části této bakalářské práce byly transformovány bakteriální buňky E. coli BL-21 (DE3) plazmidem pET21(+)/AfGcHK obsahujícím gen kódující AfGcHK, ze kterých byly následně izolovány dvě formy AfGcHK, přirozená forma a forma obsahující analog hemu,...
|
|
Strukturní charakterizace modelového zástupce hemových kyslíkových senzorů
Tajovská, Eva ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Jednou z podskupin hemoproteinů jsou hemové senzory plynů, které jsou schopny detekovat dvouatomové plynné molekuly ve svém bezprostředním okolí. Po navázání molekuly plynu na atom železa hemu v senzorové doméně těchto proteinů nebo naopak po její disociaci z tohoto atomu dochází k přenosu signálu ze senzorové domény do domény funkční a následně k regulaci důležitých buněčných funkcí. Pochopení mechanismu působení těchto senzorů je klíčové pro případné ovlivnění jejich funkce. Taková znalost by pak následně umožnila využití senzorů plynů jako terapeutických cílů pro vývoj antibiotik nové generace, pokud vezmeme v úvahu jejich přítomnost v patologických bakteriích. Předkládaná diplomová práce se zabývá modelovým zástupcem senzorových hemoproteinů detekujících plyny, kyslíkovým senzorem EcDOS z E. coli, a jeho apoformou, EcDOS His77Ala. Oba proteiny byly připraveny rekombinantní expresí a purifikací a následně spektrofotometricky charakterizovány. Pomocí gelové permeační chromatografie byl stanoven oligomerní stav EcDOS Fe(III), EcDOS Fe(II)-O2 a EcDOS His77Ala za různých podmínek (různé způsoby temperování preparátu, přítomnost substrátu c-di-GMP atd.). Dále byla studována strukturní dynamika EcDOS Fe(III), EcDOS Fe(II)-O2 a EcDOS His77Ala pomocí metody HDX-MS. Klíčová slova: hem, hemové senzorové...
|
|
Hemové senzorové proteiny detekující hem a zároveň CO
Andrlová, Dominika ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Libus, Jiří (oponent)
Hem, komplex protoporfyrinu IX s iontem železa, je důležitou součástí mnoha proteinů, které jej využívají pro přenos, uskladnění a aktivaci kyslíku nebo pro přenos elektronů. Jinou skupinu hemových proteinů tvoří hemové senzorové proteiny. Ty jsou buď schopné detekovat hem, který svou interakcí přímo reguluje funkci proteinu (senzory hemu) a/nebo hem tvoří vazebné místo pro malé plynné molekuly (O2, CO a NO) a teprve tyto molekuly řídí funkci daných senzorů (senzory plynů). V případě některých konkrétních proteinů se však ukazuje, že je můžeme současně zařadit do obou těchto podskupin, neboť je jejich funkce regulována navázáním samotného hemu, a zároveň dochází k dalšímu pozměnění funkce po navázání molekuly plynu na hem. Tato souhrnná rešerše je zaměřená na konkrétní zástupce hemových senzorových proteinů (jejichž funkce je regulována navázáním hemu), v jejichž případě byl v poslední době zaznamenán vliv molekuly CO na jejich funkci. V práci jsou shrnuty nejdůležitější objevené poznatky o těchto hemoproteinech a na jejich příkladu je diskutováno, zda se v případě některých senzorů hemu jedná zároveň i o hemové senzory plynu detekující CO. Klíčová slova: hem, hemové senzorové proteiny, hemové senzory plynu, CO senzory, senzory hemu, hemové redoxní senzory
|