|
|
Hydrogely s inkorporovanými enzymy
Geistová, Karolína ; Krouská, Jitka (oponent) ; Mravec, Filip (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá studiem inkorporace enzymů do fázově separovaných hydrogelů. Cílem práce bylo stanovit enzymovou aktivitu ve fázově separovaných gelech. Gely byly připraveny metodou suché cesty na základě interakce záporně nabitého polyelektrolytu (hyaluronan) s kladně nabitým tenzidem (Septonex). K inkorporaci do hydrogelů byly použity dva enzymy, a to bromelain a kolagenasa, a ke stanovení jejich enzymové aktivity byl jako substrát použit modifikovaný protein albumin s navázanou sulfanilamidovou skupinou (azoalbumin). Ke zjištění enzymové aktivity samotného enzymu, enzymové aktivity ovlivněné jednou ze dvou složek systému a enzymové aktivity přímo v hydrogelu, byla použita metoda UV-VIS spektrofotometrie. Bylo zjištěno, že enzym lze inkorporovat do hydrogelu. Dále bylo zjištěno, že kladně nabitý tenzid má značný vliv na hodnotu aktivity enzymu ve fázově separovaných hydrogelech.
|
|
|
Termofilní enzymy
Kuchtová, Ludmila ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Babák, Libor (vedoucí práce)
Termofilní enzymy se tvoří v organismech žijících při teplotách 60-80°C, v některých případech i vyšších a jsou za těchto teplot aktivní a stabilní. Tato práce se zabývá výskytem termofilních a hypertermofilních organismů, způsoby jejich adaptace na život v prostředí s teplotou výrazně přesahující optimum pro většinu organismů a současnými poznatky a názory na jednotlivé možné faktory zvyšující termostabilitu proteinů. Shrnuje vlastnosti a funkce termofilních enzymů a jejich současné aplikace (např. PCR, škrobárenství). Srovnává výhody a nevýhody použití těchto enzymů oproti současným používaným mesofilním enzymům. Předkládá možnosti budoucího použití termozymů v různých odvětvích průmyslu, kde by mohly nahradit některé postupy značně znečišťující životní prostředí, zjednodušit procesy a mít ekonomický význam.
|
|
|
Isolace, charakterizace a aplikace biomedicínsky významného polymeru P(3HB-co-4HB)
Krupičková, Kristýna ; Přikryl, Radek (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá izolací a charakterizací kopolymeru P(3HB-co-4HB). Teoretická část byla zpracována jako literární rešerše, která popisuje obecně polyhydroxyalkanoáty, jejich strukturu, syntézu, degradaci a izolaci. Dále jsou v práci uvedeny kopolymery obsahující 4HB jednotky a nechybí zde ani zmínka o biosyntéze a biodegradaci kopolymeru P(3HB-co-4HB). Cílem této diplomové práce bylo zjistit, které rozpouštědlo je pro extrakci kopolymeru nejlepší a následně takto vyextrahovanou fólii kopolymeru P(3HB-co-4HB) charakterizovat. Vyizolovaný kopolymer byl charakterizován pomocí plynové chromatografie, SEC-MALS termické analýzy a SEM. V druhé části práce bylo studováno uvolňování modelové biologicky aktivní látky z PHA fólie v přítomnosti různých hydrolytických enzymů. Pro simulaci bylo vybráno barvivo Rhodamin 6G, kterým byly obarveny fólie kopolymeru a fólie P(3HB). Fólie připravená z P(3HB-co-4HB) kopolymeru uvolňovala modelovou látku vyšší rychlostí než fólie z homopolymeru P(3HB), kopolymer byl také náchylnější k degradaci použitými enzymy.
|
|
|
Produkce polyhydroxyalkanoátů s využitím odpadních substrátů a jejich následná izolace
Grossová, Marie ; Babák, Libor (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Cílem práce je studium možností mikrobiální produkce polyhydroxyalkanoátů (PHA) na různých odpadních substrátech. Polyhydroxyalkanoáty nacházejí uplatnění jako biodegradabilní materiály. Pro laboratorní práci byla využita průmyslově užívaná bakterie Cupriavidus necator, jež byla kultivována s prekurzory různých monomerních jednotek s cílem produkce kopolymerů 3HB s 3HV a 4HB. Bakterie byla dále kultivována na různých odpadních substrátech, především olejnatých, s cílem dosáhnout co nejvyšší produkce polymeru. Další velkou část práce tvoří studium izolačních strategií PHA s využitím enzymů. Komerčně využívané protéazy – alkaláza a pankreatin – jsou účinnými enzymy pro rozklad bakteriální buňky. Řada optimalizačních experimentů ukázala, že při použití enzymu můžeme získat až o 13 % čistší polymer. Vzrůst čistoty PHA až nad 90% hranici byl docílen přídavkem povrchově aktivní látky, která podporuje rozpustnost buněčných komponent netvořících polymer a může zvýšit čistotu až o 20 % vůči kontrolní kultivaci. Část práce se zabývá i využitím enzymového preparátu izolovaného z bakterie Bacillus subtilis. Jeho aplikace na bakteriální kultury vedla k zisku polymeru s čistotou přesahující 95% hranici. Tyto výsledky by mohly být základem nové izolační strategie, která povede k efektivnějšímu zisku PHA z biomasy.
|
|
|
Microbial Degradation of Polycaprolactone-based Materials
Damborský, Pavel ; Stratilová, Eva (oponent) ; Hermanová, Soňa (vedoucí práce)
The thesis deals with the issue of the effect of nutritious factors and aeration on Bacillus subtilis (CCM 1999) lipase production, which was studied from the viewpoint of the crucial action of lipases on polyester chains degradation. The parameters such as bacterial growth, lipolytic activity, pH optimum, temperature optimum, thermal stability, proteolytic activity, the amount of proteins, etc. were determined in three types of media inoculated by Bacillus subtilis. One sample set of media: peptone and yeast extract (NB), medium consisted in peptone and yeast extract with the addition of 2% (w/v) glucose (NBG) and mineral solution with yeast extract (MS-YE) contained poly(-caprolactone), PCL film (Mn = 10 kDa, = 1.4). Experiments were performed for 21 days under shaking at 160 and 200 rpm. The presence of PCL caused in both types of media (NB, NBG) higher values of lipolytic activity of Bacillus subtilis indicating the participation of released low-molecular weight species as the products of PCL biodegradation. In BS-inoculated MS-YE medium low lipolytic activity of Bacillus subtilis as compared with those measured in NB and NBG media was determined even in the presence of PCL. During experiment pH value shifted from neutral (pH 7.0) to alkaline (pH 8.5 – 9.3) region for all types of media with and without PCL specimens. This fact indicates negligible pH changes in microenvironment due to the degradation products and/or metabolites. Lipolytic enzymes determined in supernatants free of bacterial cells have shown two pH optima in the presence of PCL, at pH 7 and 9. Lipase in the absence of polymer displayed optimum pH of 7. Measurement of thermal stability demonstrated that extracellular lipases as relative thermostable enzyme especially in the absence of polymer. The basic proteomic analysis by peptide mass fingerprint (PMF) of lipases produced by Bacillus subtilis at NBG medium after one week of cultivation was performed. The presence of proteins with molecular weight (19.3 kDa) close to that reported for lipases was verified through FPLC. Both SDS-PAGE and IEF-PAGE indicated presence of these proteins in both studied media (NBG vs. NBG/PCL). However, no differences have been found in the presence of PCL and no lipase was truly identified through MALDI-TOF mass spectrometry. The occurrence of degradation process in PCL samples was also documented by their gradual weight loss, which was seen in all media types as the synergic effect of lipase- and base-catalyzed ester bond scission. Model degradation study of PCL and its composite with graphene oxide (2.7 wt% GO) was performed in the presence of Bacillus subtilis in NBG medium at 30 °C and initial pH 7 for three weeks. The weight loss of PCL films gradually increased during whole degradation test up to 12 wt%. Degradation of PCL/GO composite proceeds slower as documented by maximum weight loss of 5.0 wt%. The similar character of elution curves of both PCL and its composite, determined by SEC analysis, indicated shifting to lower molecular region.
|
|
|
Studium protektivního účinku 3-hydroxybutyrátu a jeho derivátů
Černá, Klára ; Smilek, Jiří (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Cílem této bakalářské práce je studium chemických chaperonů, jakožto ochranných látek enzymů před denaturačními procesy. V experimentální části práce byly zkoumány protektivní účinky pěti vybraných potenciálních protektivních látek – derivátů 3-hydroxybutyrátu – na dvou modelových enzymech: lipáze a lysozymu. Protektivní účinky potenciálních chemických chaperonů byly zkoumány metodou dynamického rozptylu světla (DLS), kterou byla stanovována distribuce velikosti vznikajících agregátů lipázy v závislosti na teplotě při tepelně indukované denaturaci. Dále byla použita diferenciální kompenzační kalorimetrie (DSC), kterou byla stanovena teplota denaturace lysozymu v přítomnosti nebo nepřítomnosti potenciálně protektivních látek. Posledním parametrem bylo stanovení vlivu potenciálně protektivních látek při různých koncentracích na katalytickou aktivitu lipázy a stanovení residuální aktivity lipázy po aplikaci dvou denaturačních faktorů – zvýšené teploty a mražení. Ze všech testovaných strukturních analogů 3-hydroxybutyrátu byl nejvyšší protektivní efekt (stabilizace molekuly enzymu) pozorován u jantaranu, který disponuje dvěma karboxylovými skupinami. Naopak 1,3-butandiol nevykázal prakticky žádnou protektivní účinnost, což dokazuje, že přítomnost karboxylové skupiny je pro protektivní účinek zcela zásadní. Nízká protektivní účinnost butyrátu dále naznačuje, že je nezbytné, aby efektivní protektant kromě karboxylové skupiny obsahoval i další funkční skupinu – ať už karboxylovou nebo hydroxylovou. Výraznější protektivní účinek byl pozorován u 3-hydroxybutyrátu, než-li u 2-hydroxybutyrátu. Je zajímavé, že efektivní protektanty zároveň při vyšších koncentracích výrazně inhibují enzymovou aktivitu modelového enzymu, což pravděpodobně souvisí se solvatací a konformací proteinu v přítomnosti protektantů a dostupností aktivního místa pro substrát.
|
|
|
Nové fungální fukosidasy a jejich syntetický potenciál
Glozlová, Michaela ; Beránek, Martin (vedoucí práce) ; Matoušková, Petra (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Michaela Glozlová Vedoucí práce: prof. PharmDr. Martin Beránek, Ph.D. Konzultantky: doc. RNDr. Pavla Bojarová, Ph.D., Mgr. Pavlína Nekvasilová Název diplomové práce: Nové fungální fukosidázy a jejich syntetický potenciál Literární rešerše se zabývá α-L-fukosidázami, jejich výskytem, funkcí a použitím v syntéze fukosylovaných sloučenin, které byly taktéž předmětem rešerše, zejména jejich výskyt v lidském těle a účast v patologických stavech. Dále jsou zkoumány oligosacharidy lidského mléka, jejich vliv na zdraví kojence a jejich syntéza, k níž se dají využít právě α-L-fukosidázy. Experimentální část zahrnuje analýzu knihovny vláknitých hub s cílem nalezení zástupce s α-L-fukosidázovou aktivitu vůči pNP-α-L-fukosidu. Na základě hledání v genetických databázích byly vybrány a připraveny rekombinantní fungální α-L-fukosidázy a byla testována možnost jejich produkce v Pichia pastoris a Escherichia coli. Produkované enzymy byly purifikovány iontově-výměnnou chromatografií, charakterizovány a byla zkoumána jejich regioselektivita a syntetický potenciál pro syntézu fukosylovaných oligosacharidů. Klíčová slova: fukosidáza, enzym, oligosacharidy, syntéza, lidské mléko
|
|
|
Effect of enzymes on the degradation of thermosensitive copolymers for controlled release of drugs
Dávidíková, Anna Mária ; Michlovská, Lenka (oponent) ; Vojtová, Lucy (vedoucí práce)
Thermosensitive hydrogels used for drug delivery systems are of great interest these days. They serve as a drug vehicle that transport drugs to a target place and then they serve as a drug depot in the body. Hydrogels can be tuned to be able to encapsulate various drugs, to be sensitive to various external stimuli, or to degrade slower (maintain the drug longer in the body). To tune hydrogels, we need to know their degradation process and their behaviour in different degradation media; thus, we can predict how they will behave. In this proposed thesis, the degradations of various thermosensitive hydrogel solutions were studied in different degradation media. The theoretical part of this work provides a short review of thermosensitive hydrogels, their characterisation, properties, use for drug delivery systems, and degradation. Firstly, a triblock thermosensitive copolymer PLGA-PEG-PLGA that consists of poly(D,L-lactic acid-co-glycolic acid)-b-poly(ethylene glycol)-b-poly(D,L-lactic acid-co-glycolic acid) was synthesized via living ring-opening polymerization under an inert atmosphere and characterized via proton nuclear magnetic resonance spectroscopy and gel permeation chromatography. This copolymer was further used for hydrogel water solutions in 10, 15 and 20 wt. % concentrations. Hydrogel samples prepared at 37 were degraded in various media (UPW (ultrapure water), NaCl, PBS (phosphate-buffered saline), and PBS with enzyme) in the incubator for 30 days. The sample removal was set for 1, 2, 3, 7, 9, 14, 16, 21, 23 and 30 days except for the enzyme solution where we expected quick degradation. Degraded hydrogels were analysed via gel permeation chromatography and degradation media via liquid chromatography with mass spectroscopy. Gravimetric analysis and measurement of pH over time were also part of the hydrogel behaviour study. The last aim of this work was to evaluate the collected data and see whether the used enzyme affected the PLGA-PEG-PLGA hydrolytic degradation kinetics. The results proved a minor acceleration in the degradation by the enzyme. These results will serve as a foundation for further degradation studies.
|
|
|
Nové fungální fukosidasy a jejich syntetický potenciál
Glozlová, Michaela ; Beránek, Martin (vedoucí práce) ; Matoušková, Petra (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Michaela Glozlová Vedoucí práce: prof. PharmDr. Martin Beránek, Ph.D. Konzultantky: doc. RNDr. Pavla Bojarová, Ph.D., Mgr. Pavlína Nekvasilová Název diplomové práce: Nové fungální fukosidázy a jejich syntetický potenciál Literární rešerše se zabývá α-L-fukosidázami, jejich výskytem, funkcí a použitím v syntéze fukosylovaných sloučenin, které byly taktéž předmětem rešerše, zejména jejich výskyt v lidském těle a účast v patologických stavech. Dále jsou zkoumány oligosacharidy lidského mléka, jejich vliv na zdraví kojence a jejich syntéza, k níž se dají využít právě α-L-fukosidázy. Experimentální část zahrnuje analýzu knihovny vláknitých hub s cílem nalezení zástupce s α-L-fukosidázovou aktivitu vůči pNP-α-L-fukosidu. Na základě hledání v genetických databázích byly vybrány a připraveny rekombinantní fungální α-L-fukosidázy a byla testována možnost jejich produkce v Pichia pastoris a Escherichia coli. Produkované enzymy byly purifikovány iontově-výměnnou chromatografií, charakterizovány a byla zkoumána jejich regioselektivita a syntetický potenciál pro syntézu fukosylovaných oligosacharidů. Klíčová slova: fukosidáza, enzym, oligosacharidy, syntéza, lidské mléko
|
|
|
Nanoporous Enzyme-Based Impedimetric Biosensor
Košelová, Z.
The ordered nanopores surfaces has been studied in the field of biosensors for the detection of affinity interactions such as antigen-antibody or nucleic acid hybridization. Nanopores are frequently fabricated by anodic oxidation of aluminium. This method is practically simple method of highly ordered pore formation, but is not suitable for massive production. The principle of detection is usually based on the degree of pore blockage by biomolecular interaction that allows a sensitive electrochemical response. Here we show the development and characterization of the nanopore-based enzymatic biosensor for the detection of analytes. We performed and tested the concept of the simple and versatile method of nanopores formation on the electrode using non-conductive polystyrene nanoparticles. The variability in pore size was modulated by nanoparticles diameter (40 and 80 nm). We measured response of our designed biosensor using electrochemical impedance spectroscopy in presence of redox mediator at low potential. The smaller diameter of nanopores increases charge transfer resistance. Biosensors with 80 nm nanoparticles had behaviour similar to reference without nanoparticles, therefore the pore was too wide for this design. The limit of detection from Rct showed to be at most 0.01 mM for every sample type. This proposed biosensor contributes to the basic knowledge about nanopores sensors, and it could have a potential, for example, in the development of ―point of care‖ devices.
|
host ::
RSS.