|
| |
|
|
The effect of peptides derived from protein transmembrane domains on membranes
Olšinová, Marie ; Cebecauer, Marek (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Vácha, Robert (oponent)
Složitá struktura buněčných membrán vyvolává mnoho otázek týkajících se mechanismu procesů relevantních pro správnou funkci membrán. Dizertační práce představuje čtyři články zabývající se organizací lipidových membrán a interakcemi mezi lipidy a peptidy. Experimenty byly prováděny na modelových lipidových membránách. Tyto zjednodušené systémy napodobující buněčné membrány umožňují studium protein-lipidových interakcí na molekulární úrovni a studium fyzikálně-chemických vlastností membrán kontrolovaným způsobem. Pro charakterizaci systému byly použity pokročilé fluorescenční techniky jako FCS, TDFS, FLIM a anizotropie. První publikace popisuje nově navržené fluorescenční značky založené na struktuře boron dipyrromethenu, tzv. molekulární rotory, které jsou využívány jako sondy pro měření viskozity. Podrobná analýza doby života excitovaného stavu molekulárních rotorů zanořených do lipidových membrán ukázala na různou inkorporaci jednolivých značek do membrány a na změnu orientace fluoroforů v membránách o různé rigiditě. Druhá část práce se zabývá studiem vzniku lipidových nanodomén v membráně v přítomnosti cross-linkeru. Přestože standardní fluorescenční mikroskopické techniky neumožňují přímou vizualizaci nanodomén, jejich existenci jsme byli schopni detekovat pomocí FCCS a FLIM-FRET technikami....
|
|
|
Solvent Relaxation in Biomembranes: Application in the Development of Non-Viral Gene Transfection Carriers
Olžyňska, Agnieszka ; Hof, Martin (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Michl, Martin (oponent)
Re|axace rozpouštědla V biomembránách: použitípro studium nosičůurčenýchpro non.viriální genovou transfekci ABSTRAKT Pro charakterizaci vlastností lipidové membrány byla v této práci použita fluorescenční metoda ..relaxace rozpouštědla,,, která umožňuje získat poznatky o stupni hydratace a pohyblivosti hydratovaných molekul lipidů.Pomocí tÍirizných fluorescenčníchderivátů naftalenu (Patmanu Laurdanu a Prodanu) byly zkoumány rtnné částioblasti polárních lipidoqých hlav ve fosfolipidové membráně. Nejprve byla přesně určena pozice výše zmíněných sond Patmanu a Laurdanu metodou paralaxového zhášeníve dvojvrstvě složenéz DoPC. Vedle toho byla lokalizace výše zmíněných značekmapována v závislosti na obsahu kladně nabitého lipidu DoTAPu metodou arylamidového zhášenía byla zjištěna změna pozice v případě nabitésondy Patmanu. Dvojvrstvy tvořené lipidy s fosfatidylcholinovými hlavami obsahujícíruznémastné kyseliny (DOPC, POPC' OPPC and PCA6) byly také sfudovány a výsledky ukáza|y rozdi|y jak v hydrataci tak v mobilitě fosfolipidoqých hlav v závislosti na typu alifatických řetězců. Závěrečným projektem byla charakterizace vlastností liposomů, kterénacházejí využitív cílenémtransporfir genů do buněk in vitro a in vivo. Tyto liposomy jsou tvořeny neutrálním lipidem DoPC a ruzným podílem kladně nabitého DoTAPu. Měření...
|
|
|
Studium úlohy proteinů 14-3-3 v regulaci G-proteinové signalizace
Řežábková, Lenka ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent) ; Bařinka, Cyril (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Přírodovědecká fakulta Studijní program: Fyzikální chemie Mgr. Lenka Řežábková Studium úlohy proteinů 14-3-3 v regulaci G-proteinové signalizace Role of the 14-3-3 proteins in the regulation of G-protein signaling Disertační práce Školitel: doc. RNDr. Tomáš Obšil, Ph.D. Konzultanti: doc. RNDr. Petr Heřman, CSc. doc. RNDr. Jaroslav Večeř, CSc. Praha, 2012 Abstrakt Proteiny 14-3-3 skrze vazbu na více jak 300 rozličných, především fosforylovaných, proteinů regulují značné množství biologicky významných dějů, např. apoptosu, buněčný cyklus, přenos signálu či metabolické dráhy. V rámci svého Ph.D. studia jsem se zabývala úlohou proteinů 14-3-3 v regulaci G proteinové signalizace. Proteiny 14-3-3 ovlivňují G proteinovou dráhu skrze interakci s negativními regulátory G proteinové kaskády - proteiny RGS a fosducinem. Tato disertační práce si klade za cíl pomocí rozličných biochemických a biofyzikálních metod pochopit strukturní podstatu mechanismu, kterým fosforylace a vazba proteinů 14-3-3 reguluje biologickou aktivitu a funkci proteinů RGS3 a fosducinu. Povedlo se mi vyřešit strukturu komplexu RGS3/14-3-3 s nízkým rozlišením, která ukazála, že RGS doména proteinu RGS3 interaguje s málo konzervovanou oblastí proteinu 14-3-3 nacházející se mimo centrální kanál. Tato struktura společně s...
|
|
|
Molekulární mechanismy regulace forkhead transkripčního faktoru FOXO4
Bouřa, Evžen ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
8. Závěr H|avním cílem předkládané práce by|o studium molekulárních mechanismů interakce forkhead transkripčního faktoru FOXO4 s DNA a mechanismus regulace jeho vazby na DNA, zejména úloha fosforylace proteinkinasou B a regulačnífunkce l4-3- 3 proteinu. Naše qýsledky ukazují, žepro vazbu na DNA jsou u forkhead transkripčníhofaktoru FoXo4 dů|ežitéobě hraničníoblasti forkhead doméIry * jak N-koncová smyčka,která se nachází před helixem Hl, tak C-koncová část známá jako křídlo W2. Bylo zjištěno, žeodstranění jedné z těchto částís|abě snižuje DNA vazebný potenciál FOXO4-DBD, zatímco současnéodstranění obou těchto ob|astí výrazně inhibuje vazbu na DNA. Dále jsme se zaměřili na úlohu fosforylace C-koncové části forkhead domény. FoXo4 má tři fosforylačnímísta pro proteinkinasu B, z nichž jedno se nacházi přímo ve forkhead DNA vazebné doméně a to na jejím C-konci v oblasti Kíd|a W2. Zjistili jsme, že v přítomnosti N-koncové smyčky má fosfory|ace kříd|a W2 proteinkinasou B pouze ma|ý v|iv navazbu DNA. Na druhé straně v nepřítomnostitéto smyčky fosforylace křídla W2 silně inhibuje DNA vazebný potenciál FOXO4-DBD. Yazba 14-3-3 proteinu efektivně snižuje DNA vazebný potenciál FOXO4-DBD, ať užje N-koncová smyčka přítomna nebo ne. Naše ýs|edky ukazují, Že jak N-koncová, tak C-koncová část FoXo4-DBD jsou dů|eŽitépro...
|
|
|
Overcoming drug resistance: The discovery, design and characterization of new nonpeptidic inhibitors of HIV - 1 protease
Kožíšek, Milan ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Majer, Pavel (oponent) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Doktorská dizertační práce - abstrakt Objev, návrh a charakterizace nových nepeptidových inhibitorů HIV-1 proteázy RNDr. Milan Kožíšek Školitel : Doc. RNDr. Jan Konvalinka, CSc. PPrraahhaa 22001100 Katedra biochemie Přírodovědecká fakulta Karlova univerzita, Praha, Česká republika Ústav organické chemie a biochemie Gilead Sciences & IOCB Research Centre Akademie věd České republiky 3 Abstrakt HIV-1 proteáza je aspártátová proteáza, jejíž aktivita je nezbytná v životním cyklu viru HIV. Je odpovědná za štěpení virových polyproteinů na strukturní proteiny a enzymy během zrání viru. Inhibice tohoto enzymu vede k tvorbě nezralých a tedy neinfekčních virových částic. Uvedení proteázových inhibitorů na trh dramaticky změnilo úspěch léčby retrovirové infekce. Množství viru v krevní plazmě pokleslo pod zjistitelnou úroveň a vývoj nemoci se výrazně zpomalil. Nicméně se začala vyvíjet rezistence k inhibitorům. První proteázové inhibitory vykazovaly nízkou biodostupnost, měly řadu nežádoucích účinků a snadno k nim byla vyvíjena rezistence. Aby se předešlo těmto nežádoucím jevům, byly a jsou stále vyvíjeny inhibitory druhé generace. Pochopení mechanismu, kterým rezistence vůči určitému inhibitoru vzniká, je velmi důležité při vývoji nových antiretrovirotik i při klinické léčbě. Kvůli vznikající rezistenci je stále nutné...
|
|
| |
|
|
Mechanismus regulace funkce fosducinu
Kacířová, Miroslava ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Předkládaná disertační práce volně navazuje na mou práci diplomovou. Zabývá se studiem 30kDa proteinu fosducinu (Pdc) a mechanismem regulace jeho funkce prostřednictvím vazby s 28kDa adaptorovým proteinem 14-3-3. Oba tyto proteiny se účastní signální dráhy spojené s G-proteiny, především v procesu vidění. Pdc váže komplex βγ podjednotek heterotrimerního G-proteinu transducinu (Gtβγ) a tím brání zpětné reasociaci Gtβγ s podjednotkou Gtα, čímž blokuje přenos světelného signálu. Tento proces se pravděpodobně uplatňuje při dlouhodobé adaptaci na změnu intenzity světla. Regulační funkce Pdc je dále regulována jeho fosforylací a následnou vazbou na protein 14-3-3. Na základě dostupných dat bylo spekulováno, že vazba 14-3-3 je klíčová pro inhibici interakce mezi fosforylovaným Pdc (Pdc-PP) a Gtβγ. Vznik komplexu 14-3-3/Pdc-PP pak vede k reasociaci trimerního transducinu a zesílení přenosu světelného signálu. Mechanismus, jakým protein 14-3-3 inhibuje interakci Pdc s Gtβγ, je však stále neznámý. Cílem této disertační práce bylo objasnit strukturu volného Pdc a jeho komplexu s proteinem 14-3-3 a s pomocí získaných dat navrhnout mechanismus regulace funkce Pdc. Struktura Pdc a komplexu 14-3-3/Pdc-PP byla studována celou řadou biofyzikálních metod včetně maloúhlového rozptylu rentgenového záření (SAXS), NMR,...
|
|
|
Mechanismus přenosu signálu hemovými senzorovými proteiny detekujícími kyslík
Stráňava, Martin ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Macek, Tomáš (oponent)
CZ Hemové senzorové proteiny, které detekují plynné molekuly, hrají v bakteriální fyziologii důležitou roli v regulaci mnoha procesů jako je např. buněčná diferenciace, virulence, tvorba biofilmu nebo mezibuněčná komunikace. Jejich struktura se vyznačuje typickou modulární architekturou, kde různé senzorové domény (nejčastěji na N-konci) regulují aktivitu katalytických neboli funkčních domén (nejčastěji na C-konci). V této disertační práci jsme se zaměřili na studium tří zástupců ze skupiny senzorových proteinů detekujících kyslík a to histidinkinasy AfGcHK, diguanylátcyklasy YddV, fosfodiesterasy EcDOS a dále na studium proteinu RR, který je interakčním partnerem AfGcHK. Hlavním cílem disertační práce bylo prostudovat intraproteinový/interdoménový přenos signálu u dvou zástupců hemových senzorových proteinů s globinovým uspořádáním senzorové domény (AfGcHK, YddV) a u jednoho zástupce s PAS uspořádáním senzorové domény (EcDOS). Dalším cílem bylo popsat interproteinový přenos signálu u dvousložkového systému AfGcHK-RR a strukturně charakterizovat tyto dva interakční partnery. Důraz byl kladen také na studium interakce modelových senzorových domén s různými signálními molekulami a popis funkce jednotlivých aminokyselin účastnících se vazby těchto signálních molekul. Studiem...
|
|
|
Utilization of pulse labelling techniques for studying the dynamics of proteins and protein complexes
Polák, Marek ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Vrbacký, Marek (oponent)
(In Czech) Hmotnostní spektrometrie (MS) se stala častou technikou pro sledování struktury a dynamiky proteinů a proteinových komplexů. I když techniky založené na MS detekci nemohou poskytovat informace s vysokým rozlišením, jako je např. rentgenová difrakce, nukleární magnetická rezonance (NMR), nebo kryo-elektronová mikroskopie (cryo-EM), jsou dobrým nástrojem z hlediska poskytování informaci ohledně dynamiky, struktury a interakcí analytů s dalšími molekulami, např. ligandy. Tato doktorská práce představuje přínos do oblasti strukturní biologie při využití kovalentního značení, tzv. rychlé fotochemické oxidace proteinů (FPOP) a oxidace singletním kyslíkem (1 O2) pro studium struktury, dynamiky a interakcí proteinů a proteinových komplexů s dvoušroubovici DNA.V první části práce byla metoda FPOP využita k studiu struktury komplexu FOXO4-DAF16, která poukázala na možnosti analýzy takového komplexu pomocí přístupů "bottom-up" a "top-down". Dále je zde představena strategie izotopové deplece pro strategii "top- down", kde je demonstrována její výhoda ve spojení s multiCASI-ECD za účelem získaní nejvyšší možné strukturní informace ohledně interakce FOXO4 s IRE. Studie ukazuje, jak mohou informace získané ze strukturní proteomiky vést k vytvoření in-silico modelů protein-DNA komplexů, jejichž...
|
host ::
RSS.