Original title:
CLEA imobilizace enzymů z hub bílé a hnědé hniloby
Authors:
Blahutová, Andrea Document type: Master’s theses
Year:
2020
Language:
cze Abstract:
[cze][eng] Vhodnou kokultivací hub lze dosáhnout synergického působení jejich enzymatických systémů a získat tak enzymy o přirozeně vyšší aktivitě. V této diplomové práci byla hledána houba hnědé hniloby, jež by indukovala aktivitu lakázy (Lac), kterou produkuje známá houba bílé hniloby Trametes versicolor. Na základě screeningu kokultivací této houby s houbami hnědé hniloby (Daedalea quercina, Fomitopsis pinicola, Laetiporus sulphureus, Osmoporus odoratus, Piptoporus betulinus a Serpula lacrymans) byla vybrána kokultura Trametes versicolor/Serpula lacrymans (TV/SL), u které se projevil hledaný účinek a produkovala Lac o vyšší aktivitě než samotná monokultura. Podmínky precipitace a CLEA (cross-linked enzyme aggregates) imobilizace enzymů z vybrané kokultury (se zaměřením na Lac) byly následně optimalizovány. Optimální podmínky precipitace byly pH 6, 65 hm. % síranu amonného a doba srážení 30 min. Optimalizovaný precipitát byl následně imobilizován metodou CLEA, přičemž optimální koncentrace síťovacího činidla glutaraldehydu byla stanovena na 50 mM a optimální doba síťování na 30 min. Výsledkem CLEA imobilizace byl multi-CLEA agregát o vysoké aktivitě Lac. Následně bylo pro imobilizovanou i volnou Lac stanovené pH optimum a stabilita a teplotní optimum a stabilita. Obě formy Lac měly pH optimum v silně kyselém prostředí (pH 2,6) a stabilitu obecně projevovaly v silně až mírně kyselém prostředí. Teplotní optimum volné Lac bylo při 30 °C a imobilizované Lac při 35 °C. Teplotní stabilita byla pro obě formy Lac podobná a pohybovala se v rozmezí od 25 do 50 °C. pH a teplotní stabilita volné a imobilizované Lac měly velmi podobný trend vývoje, významným rozdílem však byla jejich aktivita, kdy aktivita imobilizované Lac byla průměrně až 50krát vyšší než aktivita volné Lac. Účinnost imobilizovaného preparátů byla poté otestována na degradaci polyfenolických sloučenin (TP) v bílém a červeném víně. U bílého vína byla dosažena maximální degradace TP 58 % a u červeného 39 %. Rozdílný účinek degradace mezi bílým a červeným vínem může být přisuzován odlišnému zastoupení polyfenolických sloučenin v jednotlivých odrůdách. Roli při regulaci polyfenolů ve vínech hrají také vznikající polyfenolické meziprodukty. Připravená multi-CLEA z TV/SL o vysoké aktivitě Lac nabízí potenciální využítí i v jiných odvětvích průmyslu. Kokultivace hub pro přirozený zisk enzymů o vysokých aktivitách či produkci nových sekundárních metabolitů a možnosti imobilizace jsou neustálým tématem mnoha studií.The appropriate co-cultivation of fungi can lead to a synergic interaction between the enzymatic systems, resulting into the production of enzymes with naturally higher activity. In this diploma thesis, we looked for a brown rot fungi, which would induce the activity of laccase produced by the already well known white rot fungus Trametes versicolor. Based on the screening of the co-cultivations of Trametes versicolor with brown rot fungi (Daedalea quercina, Fomitopsis pinicola, Laetiporus sulphureus, Osmoporus odoratus, Piptoporus betulinus and Serpula lacrymans), the co-culture Trametes versicolor/Serpula lacrymans (TV/SL) was chosen for the following experiments, since the laccase activity of this co-culture was higher in comparison with the monoculture TV. The conditions of precipitation and CLEA immobilization of the enzymes from the chosen co-culture were optimized (focusing on laccase). The optimal conditions of the precipitation were pH 6, 65 wt. % of ammonium sulphate and 30 min. The optimized precipitate was then immobilized by the CLEA method and the optimal concentration of the cross-linking agent was 50 mM and the optimal time of cross-linking was 30 min. The result of the CLEA immobilization was a multi-CLEA aggregate with high activity of laccase. Then, pH optimum and stability and thermal optimum and stability were determined. The pH optimum of both formes of enzymes was found to be at very acidic pH (pH 2.6) and their pH stability was ranged between very acidic and slightly acidic pH values. The thermal optimum of the free laccase was found to be at 30 °C, and 35 °C for the immobilized laccase. The thermal stability was similar for both forms of laccase and it was observed in the range between 25 and 50 °C. The developing trends of the pH and thermal stability of the free and immobilized laccase were similar, but the significant difference was between their laccase activities. The activity of the immobilized laccase was approximatly 50 times higher than the activity of the free laccase. The efficiency of the multi-CLEA was then tested in regard of the degradation of total polyphenols (TP) in white and red wine. The highest degradation of TP in white wine was 58 % and in red wine 39 %. Different rate of degradation between white and red wines might be explained by the different content of polyphenolic compounds in each type of wine. Polyphenolic intermediates, which are produced during the degradation process, also play an important role. The prepared multi-CLEA from TV/SL with high activity of laccase offer many potential applications in other industries. Finding fungal co-cultures that produce enzymes with higher activites or new secondary metabolites, has been a constant topic of many studies, as well as the immobilization methods.
Keywords:
CLEA; co-cultivation; co-culture; degradace; degradation; immobilization; imobilizace; kokultivace; kokultura; laccase; lakáza; polyfenolic compounds; polyfenolické sloučeniny; Serpula lacrymans; Trametes versicolor
guest ::
