|
|
Úloha fosforylace proteinů v progamické fázi vývoje samčího gametofytu tabáku
Fíla, Jan ; Honys, David (vedoucí práce) ; Paleček, Jan (oponent) ; Smýkal, Petr (oponent)
Zralý pyl tabáku obsahuje silně dehydratovanou cytoplazmu a je metabolicky neaktivní. Po rehydrataci cytoplazmy je jeho metabolizmus nastartován a po dokončení aktivace vyrůstá pylovou aperturou pylová láčka. Změny v zavodnění cytoplazmy spolu s nastartováním metabolizmu jsou doprovázeny regulací translace i post-translačních modifikací (zejména fosforylace) přítomných proteinů. V této disertační práci jsou prezentovány fosfopeptidy ze zralého pylu tabáku virginského (Nicotiana tabacum), pylu aktivovaného in vitro 5 min a pylu aktivovaného in vitro 30 min. Z každého stádia byl získán celkový proteinový extrakt, jenž byl naštěpen trypsinem a získaná peptidová směs byla obohacena metodou MOAC (afinitní chromatografie s využitím kovového oxidu/hydroxidu) s matricí z oxidu titaničitého. Fosfopeptidy v obohaceném eluátu byly identifikovány kapalinovou chromatografií v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS). Celkem bylo identifikováno 471 fosfopeptidů, nesoucích 432 přesně lokalizovaných fosforylačních míst. Získané fosfopeptidy pocházely z 301 fosfoproteinů, které spadaly do třinácti funkčních kategorií. Převládajícími funkcemi se staly transkripce, syntéza proteinů, cílení a skladování proteinů a přenos signálu. Mnohé fosfopeptidy podléhaly koncentračním změnám mezi třemi...
|
|
|
Role of TCTP1 in plant reproduction
Pitoňak, Oliver ; Hafidh, Said (vedoucí práce) ; Lafon Placette, Clément (oponent)
TCTP je evolučně konzervovaný eukaryotní protein zapojený do regulace řady buněčných procesů, například translace, buněčného cyklu a buněčné smrti. U člověka je TCTP z buňky sekretován a účastní se imunitní odpovědi. Pro jeho extracelulární funkci je zásadní schopnost dimerizace přes terminální cysteinový zbytek. Porovnání sekvencí TCTP u různých eukaryotních organismů odhalilo, že tento zbytek je evolučně konzervován nejen u živočichů, ale i u rostlin. Na rozdíl od živočišných modelů jsou poznatky o TCTP v rostlinách omezené. V genomu huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana) jsou kódovány dva paralogní geny TCTP1 a TCTP2. TCTP1 je silně exprimován v pylu. Publikované studie ukazují na jeho úlohu ve vývoji embrya a růstu pylové láčky. V této diplomové práci byla dále studována úloha TCTP1 v pohlavním rozmnožování rostlin s využitím metod fenotypové charakterizace mutantní linie a analýzy subcelulární lokalizace. V heterologním bakteriálním systému byl exprimován rekombinantní TCTP1 z huseníčku rolního a jeho potenciální interakční partneři BRL2 a TTL3. Charakterizace mutantní linie tctp-1 naznačila roli TCTP1 v růstu pylové láčky. TCTP1 exprimován pod kontrolou nativního promotoru lokalizoval v cytoplazmě pylu a pylové láčky. Rekombinantní AtTCTP1 v in vitro podmínkách vytvářel dimery. Mutace...
|
|
|
"It takes two to tango"; partnerské signály a impulzy v rostlinném světě
Vlasák, Jonáš ; Honys, David (vedoucí práce) ; Vaňková, Radomíra (oponent)
Tato práce shrnuje současné poznatky o komunikaci partnerů během progamické fáze pylu se zaměřením na rostliny čeledi brukvovitých. Po specifickém přichycení pylu na bliznu stejného druhu se peptidy pylového tryfinu vážou na receptory papilární buňky. Peptidy PCP (POLLEN COAT PEPTIDE) kompetitivně inhibují autokrinní signalizaci vnímanou receptorem FERONIA v papilární buňce a tím umožní přijetí pylu. Naopak pylový protein SCR (S-LOCUS CYSTEIN RICH PROTEIN) detekovaný receptorem SRK (S-LOCUS RECEPTOR KINASE) určuje inkompatibilitu pylu. Pro růst pylové láčky je zásadní regulace orientované sekrece. Během růstu láčky čnělkou a vodícím pletivem jsou vnímány komponenty extracelulární matrix i přímo tuhost prostředí a tlak. Na své cestě k vajíčku láčka dozrává, dochází ke změnám genové exprese a získává kompetenci k vnímání signálů. Láčka z vodicího pletiva zahýbá na poutko díky ovulárním signálům. Láčka je přijata synergidami, komunikace probíhá pomocí peptidů RALF (RAPID ALKALIZATION FACTOR) a receptoru FERONIA. Signalizace vyústí v prasknutí pylové láčky a dopravení spermatických buněk k samičím gametám. Spermatické buňky se navážou na vaječnou buňku a centrální buňku zárodečného vaku a po potvrzení správného rozmístění se samičími gametami fúzují. Po oplodnění vaječná buňka degraduje signální molekuly a...
|
|
|
Revealing phosphoproteins playing role in tobacco pollen activated in vitro
Fíla, Jan ; Honys, David (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
6 Abstract in Czech Po dopadu na bliznu se zralý pyl tabáku rehydratuje, aktivuje a klíčí z něj pylová láčka. Rehydratace je doprovázena de-represí skladovaných mRNA, z nichž se syntetizují nové proteiny. Při vývoji zralého pylu v rychle rostoucí pylovou láčku se velmi pravděpodobně uplatňují také posttranslační modifikace proteinů, konkrétně fosforylace, jež se podílí na regulaci celé řady buněčných procesů. Vzhledem k tomu, že pouze malý podíl proteinů je v daném okamžiku v buňce fosforylován, bývá nevyhnutelné využít nejrůznější obohacovací techniky. Pro obohacení fosfoproteinů z celkového proteinového extraktu zralého pylu a pylu aktivovaného in vitro 30 minut byla v této diplomové práci aplikována afinitní chromatografie s využitím kovového oxidu/hydroxidu (MOAC), kde byl matricí hydroxid hlinitý. Získaná obohacená frakce byla rozdělena nezávisle dvěma metodami; klasickou dvojrozměrnou elektroforézou (2D-GE) a kapalinovou chromatografií (LC). Hmotnostní spektrometrií (MS) byly analyzovány vzorky získané oběma způsoby dělení, a celkem tak bylo identifikováno 139 fosfoproteinových kandidátů. Fosfopeptidové obohacení využívající oxid titaničitý vedlo k lokalizaci 51 fosforylačních míst, a tak rozšířilo počet přesně identifikovaných fosforylačních míst na celkových 52. Klíčová slova: samčí gametofyt, zralý...
|
|
|
Využití fluorescenční mikroskopie pro bližší popis dynamiky proteinů ALBA u Arabidopsis thaliana
Popelářová, Anna ; Honys, David (vedoucí práce) ; Vosolsobě, Stanislav (oponent)
Proteiny ALBA byly objeveny u Archaea před více než 30 lety. Postupně bylo zjištěno, že se vyskytují i u eukaryot a jejich struktura je velmi konzervovaná. V obou zmíněných doménách organizmů byla pozorována funkční forma těchto proteinů v dimerech schopných vazby DNA i RNA. Jejich role se však během evoluce rozrůznily a mezi jednotlivými organizmy se liší. U Archaea se ALBA podílí na organizaci genomu a také na interakcích s RNA. U eukaryot existují dvě podrodiny proteinů ALBA nazvané Rpp20 a Rpp25. Některé organizmy mají jen jeden protein ALBA z každé podrodiny, ale například u rostlin byly geny ALBA zmnoženy. Tyto proteiny spolu mohou interagovat a podílet se na ontogenetickém vývoji a reakcích na stres. Dle některých studií by se u Arabidopsis thaliana mohly proteiny ALBA nacházet v jádře a podílet se na udržování stability DNA nebo sestřihu transkriptů pre-rRNA. Podle jiných studií jsou lokalizovány v cytoplazmě a mají úlohu v metabolizmu a reakci na stres. V genomu A. thalina bylo identifikováno šest různých genů ALBA, tři z každé podrodiny. V této práci byly zkoumány proteinové interakce mezi všemi těmito proteiny metodou bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC) a bylo zjištěno, že spolu interagují především proteiny mezi podrodinami. Dále byla pozorována lokalizace těchto proteinů v...
|
|
|
Úloha fosforylace proteinů v progamické fázi vývoje samčího gametofytu tabáku
Fíla, Jan
Zralý pyl tabáku obsahuje silně dehydratovanou cytoplazmu a je metabolicky neaktivní. Po rehydrataci cytoplazmy je jeho metabolizmus nastartován a po dokončení aktivace vyrůstá pylovou aperturou pylová láčka. Změny v zavodnění cytoplazmy spolu s nastartováním metabolizmu jsou doprovázeny regulací translace i post-translačních modifikací (zejména fosforylace) přítomných proteinů. V této disertační práci jsou prezentovány fosfopeptidy ze zralého pylu tabáku virginského (Nicotiana tabacum), pylu aktivovaného in vitro 5 min a pylu aktivovaného in vitro 30 min. Z každého stádia byl získán celkový proteinový extrakt, jenž byl naštěpen trypsinem a získaná peptidová směs byla obohacena metodou MOAC (afinitní chromatografie s využitím kovového oxidu/hydroxidu) s matricí z oxidu titaničitého. Fosfopeptidy v obohaceném eluátu byly identifikovány kapalinovou chromatografií v kombinaci s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS). Celkem bylo identifikováno 471 fosfopeptidů, nesoucích 432 přesně lokalizovaných fosforylačních míst. Získané fosfopeptidy pocházely z 301 fosfoproteinů, které spadaly do třinácti funkčních kategorií. Převládajícími funkcemi se staly transkripce, syntéza proteinů, cílení a skladování proteinů a přenos signálu. Mnohé fosfopeptidy podléhaly koncentračním změnám mezi třemi...
|
|
|
Funkční charakterizace proteinů rodiny Alba u huseníčku rolního
Kočová, Helena ; Honys, David (vedoucí práce) ; Fischer, Lukáš (oponent)
(česky) Proteiny rodiny Alba byly identifikovány u Archaea a eukaryot a jsou řazeny mezi jedny z nejstarších a nejkonzervovanějších proteinů vázajících nukleové kyseliny (DNA i RNA). Jejich vazebné preference a role se u jednotlivých vývojových skupin velmi různí. Zatímco u skupiny Crenarchaea se jedná o chromatinové proteiny, u Euryarchaea a eukaryot se předpokládá jejich role v metabolismu RNA. Proteiny ALBA jsou dobře charakterizovány u člověka, kde tvoří součást komplexu RNAsy P/MRP a u jednobuněčných parazitů, např. Plasmodium či Trypanosoma, kde se podílejí na regulaci životního cyklu. Z rostlinného světa je však poznatků prozatím málo. Cílem této práce je přispět k pochopení role proteinů ALBA u modelové rostliny huseníčku rolního (Arabidopsis thaliana). Vzhledem k minimálnímu vlivu na vývoj a reprodukci rostlin při vyřazení jednotlivých genů metodou CRISPR/Cas9 a vysoké sekvenční podobnosti homologů u A. thaliana, lze předpokládat jejich funkční zastupitelnost. Z tohoto důvodu byl stejnou metodou vytvořen trojnásobný mutant, u kterého bylo pozorováno zpoždění nástupu kvetení o několik dní. Tvorba dimerů proteinů ALBA již byla potvrzena u mnohých studovaných organismů. V této práci byla pro stanovení těchto interakcí použita metoda BiFC. Analýza získaných dat ve většině případů naznačuje...
|
|
|
Rozmnožování krytosemenných rostlin a teplotní stres
Nedvědová, Kateřina ; Honys, David (vedoucí práce) ; Vítámvás, Pavel (oponent)
Tato bakalářská práce je literární rešerší shrnující účinky vysokoteplotního stresu na reprodukční vývoj krytosemenných rostlin a toleranční mechanismy reprodukčního vývoje. Rostliny jsou průběžně vystavovány měnícím se podmínkám prostředí a stále se zvyšujícím teplotám. Reprodukční vývoj, zvláště vývoj samčího gametofytu, je na tyto změny obzvláště citlivý. To vede k defektnímu vývoji, sterilnímu pylu a nižšímu počtu semen, což ovlivňuje produktivitu a výnos plodin. Proto je důležité těmto změnám, a především tolerančním mechanismům, porozumět. Klíčová slova: reprodukce, krytosemenné rostliny, teplotní stres, tolerance, samčí gametofyt, samičí gametofyt
|
|
|
Androgeneze
Kočová, Helena ; Honys, David (vedoucí práce) ; Kocábek, Tomáš (oponent)
(česky) Androgeneze v rostlinné říši je zajímavý jev, kdy je nový jedinec regenerován ze samčího gametofytu. Mající gametofytický, tedy haploidní počet chromozomů, tyto rostliny mají potenciální využití jak ve výzkumu, tak i pro tvorbu nových genotypů. Zdvojením genetické informace se totiž získají kompletně homozygotní rostliny, které mohou být použité ke šlechtění. Mikrospory zároveň představují unikátní systém pro studium totipotence, buněčné proliferace, diferenciace i embryogeneze. Nicméně u mnohých významných plodin a zároveň i u některých modelových rostlin nebyla technologie androgeneze dosud efektivně zvládnutá. Cílem této bakalářské práce je shrnout známé vědomosti o androgenezi, od historického kontextu až po nejnovější poznatky, včetně metod tvorby, průběhu vzniku, komplikací a nakonec též možného využití získaných dihaploidních rostlin. Klíčová slova: androgeneze, samčí gametofyt, mikrosporová embryogeneze, pyl, totipotence, buněčná diferenciace, stres, haploid
|
|
|
Characterization of eukaryotic translation initiation factor 3 subunits (eIF3) in A. thaliana male gametophyte
Linhart, Filip ; Hafidh, Said (vedoucí práce) ; Retzer, Katarzyna (oponent)
Od RNA k proteinu je iniciace translace a proteosyntéza zprostředkovávaná trans-vazebnými faktory, jež rozeznávají charakteristiky mRNA, společná téměř všem eukaryotům. Komplex tvořící eukaryotický translační iniciační faktor 3 (eIF3) je vysoce konzervovaným proteinovým komplexem, který rozpoznává složky 5' čepičky mRNA za cílem iniciace translace. eIF3 se skládá z devíti podjednotek, z nich tři mají dvě izoformy: eIF3A, eIF2B1, eIF3B2, eIF3C1, eIF3C2, eIF3D, eIF3E, eIF3F, eIF3G1, eIF3G2, eIF3H a eIF3K. Tato práce se zabývá funkční charakterizací, expresí a subcelulární lokalizací eIF3B1, eIF3B2 a eIF3E v samčím gametofytu Arabidopsis thaliana a interakcí eIF3E s komplexem Constitutive photomorphogenesis 9 (COP9) ve funkci regulačního komplexu posttranslační kontroly eIF3E. Ukazujeme, že ztráta funkce eif3b1 či eif3b2 se neprojevuje gametofytickou letalitou a že tyto dva proteiny se zřejmě funkčně doplňují, zatímco mutace eif3e má za důsledek letalitu samčího gametofytu. Pouze eif3b1 projevuje defekty následně po oplodnění, během vývoje semene. Studie genové exprese, užívající veřejně dostupná data o expresi a promotorové aktivitě prokazují vysokou úroveň exprese podjednotek eIF3 v zónách s intenzivním buněčným dělením, tedy listového primodia, kořenového meristému a elongační zóny, taktéž jako ve...
|
host ::
RSS.