|
|
Structural studies of selected protein complexes involved in signal transduction
Honzejková, Karolína ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Bouřa, Evžen (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Protein-proteinové interakce jsou klíčové pro většinu fyziologických i patofyziologických dějů. Detailní charakterizace těchto interakcí je proto nezbytná nejen k porozumění podstaty těchto dějů, ale i pro návrh strategií, jak tyto interakce cíleně ovlivňovat. Tato práce se zaměřuje na studium struktury a interakcí několika proteinů a jejich komplexů. ASK1 (z anglického "apoptosis signal-regulating kinase 1") je mitogeny aktivovaná proteinkinasa kinasa kinasa (MAP3K), která aktivuje dráhy proteinkinas p38/JNK, čímž směruje buňky k zánětlivé reakci nebo apoptóze. ASK1 interaguje s thioredoxinem (TRX), malou dithioloxidoreduktasou, která inhibuje ASK1, nicméně mechanismus této inhibice je nejasný. CaMKK1 a CaMKK2 jsou Ca2+ /kalmodulin (CaM)- dependentní proteinkinasy, které regulují např. energetickou rovnováhu buňky, paměť či zánět. Obě jsou inhibovány proteiny 14-3-3, ale navzdory svým doménovým a sekvenčním podobnostem je rozsah inhibice zprostředkovaný proteiny 14-3-3 odlišný. Estrogenový receptor alfa (ERα) je jaderný receptor, který se podílí na vzniku rakoviny prsu. Pro léčbu tohoto onemocnění se používá tamoxifen, antagonista ERα, který však často způsobuje vznik rezistence. Proteiny 14-3-3 interagují s ERα a inhibují jeho transkripční aktivitu, povaha této interakce je však stále nejasná....
|
|
|
Functional analysis of the ERK signaling pathway in epithelial cells
Galvánková, Kristína ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Rösel, Daniel (oponent)
Signální dráha MAPK/ERK, která je v rámci eukaryot evolučně konzervovaná, je jednou z nejintenzivněji studovaných signálních drah a skládá se z třístupňové kaskády proteinkináz Raf-MEK-ERK. Široká škála extracelulárních signálů je prostřednictvím sekvenčních fosforylací jednotlivých členů této dráhy přenášena od receptorů k stovkám substrátů. Díky přesné časové a prostorové regulaci jednotlivých fosforylačních událostí je docíleno specifické odpovědi buňky, která vede ke správnému průběhu fyziologických procesů včetně genové exprese, proliferace, diferenciace, migrace a apoptózy. Narušení regulačních mechanismů této dráhy může vést k patologické signalizaci, například k nádorové transformaci. Specifická regulace signalizace je mimo jiné zajištěna existencí více izoforem na každé úrovni signální dráhy ERK. Funkční rozdíly mezi efektorovými proteinkinázami ERK1 a ERK2 jsou již dlouho diskutovanou problematikou, nicméně stále není jasné, jaký význam mají v dosažení správné buněčné odpovědi. V této práci jsme se zaměřili na funkční charakterizaci izoforem ERK1 a ERK2 v epiteliálních buňkách MDCK. Konkrétně jsme sledovali vliv inaktivace izoformy ERK2 na morfologii a expresi vybraných substrátů. Zjistili jsme, že inaktivace izoformy ERK2 vede k poruchám formování epitelu, jelikož buňky ztrácejí svůj...
|
|
|
Studium interakcí proteinkinasy CaMKK2 s kalmodulinem pomoci fluorescenční spektroskopie.
Mikulů, Martina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Ca2+ /kalmodulin-dependentní proteinkinasy jsou členy významné CaMK rodiny, která se účastní CaMK kaskády. Jedním z nich je Ca2+ /kalmodulin-dependentní proteinkina- sakinasa 2 (CaMKK2), která je aktivována vazbou komplexu Ca2+ /CaM. CaMKK2 se od většiny ostatních proteinkinas liší zejména strukturou v blízkosti αE-helixu a auto- inhibiční domény. Protože se autoinhibiční doména překrývá s Ca2+ /CaM-vazebnou doménou, lze před- pokládat, že vazba kalmodulinu způsobuje strukturní změny v oblastech interagujících s autoinhibiční doménou a ovlivňuje přístupnost těchto oblastí pro jiné molekuly. Pro ověření tohoto předpokladu byl exprimován a vypurifikován mutant CaMKK2 W445F, v jehož sekvenci se nachází pouze jeden tryptofanový zbytek na pozici 374, který se nachází v blízkosti sledované oblasti helixu αE. Strukturní změny v této oblasti byly pozorovány prostřednictvím zhášení intenzity fluorescence tryptofanového zbytku Trp374 prostřednictvím akrylamidu.Tato měření mohou poskytnout informaci o přístupnosti sle- dované oblasti. Porovnání zhášení fluorescence v přítomnosti a nepřítomnosti kalmodu- linu naznačilo, že při interakci CaMKK2 s kalmodulinem dochází ve sledované oblasti v blízkosti Trp374 ke...
|
|
|
Biofyzikální charakterizace N-koncové části proteinkinasy ASK1.
Honzejková, Karolína ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Proteinkinasa ASK1 (z anglického "apoptosis signal-regulating kinase 1") je apikální kinasa mitogeny aktivované proteinkinasové kaskády (tzv. MAPK kaskády). Její aktivita je spouštěna např. reaktivními formami kyslíku, cytokiny, stresem endoplasmatického retikula či osmotickým stresem. Aktivace ASK1 má za následek spuštění metabolických drah, na jejichž počátcích stojí mitogeny aktivované proteinkinasy (MAPK) p38 a c-Jun N-koncová kinasa (JNK). Aktivace těchto kinas vede k zánětu nebo smrti buňky. Dysregulace ASK1 je asociována s rozvojem patologických stavů, jakými jsou neurodegenerativní, kardiovaskulární či nádorová onemocnění, což z tohoto proteinu činí potenciální cíl terapeutických zásahů. Aktivita proteinkinasy ASK1 je regulována prostřednictvím protein-proteinových interakcí, mezi hlavní negativní regulátory ASK1 řadíme rodinu dimerních proteinů 14-3-3 a redoxní protein thioredoxin 1. Příkladem pozitivních regulátorů jsou faktory asociované s TNF receptorem. Kromě toho je aktivita ASK1 přísně regulována prostřednictvím oligomerizace. Navzdory neustálému pokroku, kterého je dosahováno v rámci studia tohoto proteinu, je přesný molekulární mechanismus regulace ASK1 a vliv oligomerizace na tento proces nejasný, částečně z důvodu nedostatku strukturních dat. Interakce N-koncových částí dvou...
|
|
|
Strukturní charakterizace lidské proteinkinasy CaMKK2 a jejích interakcí s vazebnými partnery
Koupilová, Nicola ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
4 Abstrakt Ca2+/kalmodulin-dependentní proteinkinasa kinasa 2 (CaMKK2) patří do rodiny serin/threonin proteinkinas, které se účastní vápníkové signální dráhy. Při zvýšení intracelulární koncentrace vápenatých kationtů dochází k aktivaci kalmodulinu (CaM), který následně aktivuje své vazebné partnery, mezi které patří CaMKII, CaMKIII, CaMKK1 a CaMKK2. CaMKK2 následně aktivuje prostřednictvím fosforylace proteinkinasy CaMKI, CaMKIV a AMP-dependentní kinasu, AMPK. Přirozeně se v buňkách CaMKK2 vyskytuje v autoinhibovaném stavu, který je způsobený sterickým bráněním aktivního místa autoinhibiční doménou. Při vazbě s kalmodulinem dochází k odklonění autoinhibiční domény a tím ke zpřístupnění aktivního místa. Po aktivaci dochází u CaMKK k autofosforylaci a tím ke zvýšení aktivity. Negativní regulace je způsobena fosforylací cAMP-dependentní proteinkinasou A (PKA) a GSK3. Pro CaMKK1 i CaMKK2 byla identifikována místa, která jsou fosforylována PKA. Dvě z nich jsou součástí vazebného motivu pro proteiny 14-3-3. Předchozí studie ukázaly, že protein 14-3-3 udržuje fosforylovanou CaMKK2 v inhibovaném stavu tím, že brání defosforylaci S495, který blokuje vytvoření vazby s kalmodulinem. Nicméně je nejasné, jestli je to jediná úloha proteinu 14-3-3 v regulaci CaMKK2. Hlavním cílem této diplomové práce byla optimalizace...
|
|
|
The role of ERK1 and ERK2 protein kinases in the MAPK/ERK signaling
Galvánková, Kristína ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Dráber, Peter (oponent)
MAPK/ERK je naprieč organizmami vysoko konzervovaná signálna dráha, zabezpečujúca procesy nevyhnutné pre život, akými sú proliferácia, diferenciácia, apoptóza alebo migrácia buniek. Všetky tieto procesy sú výsledkom spracovania celej rady extracelulárnych signálov prenášaných od receptorov cez kaskádu proteínkináz Raf, MEK a ERK pomocou následných fosforylácií. Raf fosforyluje MEK a MEK fosforyluje a aktivuje proteínkinázu ERK, ktorá následne fosforyluje a tým reguluje široké spektrum substrátov na rôznych miestach v bunke. Keďže ostatné dve proteínkinázy majú obmedzený počet substrátov, práve ERK fosforyláciou stoviek popísaných substrátov v daný moment zásadne vplýva na konečnú odpoveď bunky. Ovplyvnené substráty potom určujú výslednú bunkovú odpoveď na extracelulárny signál. Celá signálna dráha je v jednotlivých krokoch prísne regulovaná za pomoci interakčných partnerov a ďalších adaptorových proteínov. Nesprávna regulácia dráhy, ako aj mutácie jednotlivých proteínkináz vedú k závažným patologickým prejavom. Na úrovni proteínkinázy ERK sa vyskytujú dve izoformy, ERK1 a ERK2, ktoré sú z viac než 80 % identické. Ich veľká sekvenčná aj funkčná podobnosť vyvoláva otázky o ich evolučnej konzervovanosti a taktiež o tom, či majú tieto izoformy rozdielne funkcie, alebo sú funkčne zameniteľné. Cieľom...
|
|
|
Studium mechanismů regulace vybraných proteinkinas
Petrvalská, Olívia
Proteiny 14-3-3 skrze vazbu více než 300 vazebných partnerů regulují značné množství biologicky významných dějů, např. apoptosu, buněčný cyklus, přenos signálu či metabolické dráhy. V rámci této disertační práce byla studována úloha proteinů 14-3-3 v regulaci dvou vybraných proteinkinas ASK1 a CaMKK2. Hlavním cílem práce bylo pochopit strukturní podstatu mechanismů, kterými fosforylace a vazba proteinů 14-3-3 regulují aktivitu těchto proteinkinas pomocí různých biochemických a biofyzikálních metod, zejména metod bodové mutagenese, měření enzymové aktivity, analytické ultracentrifugace, maloúhlového rozptylu rentgenového záření, chemického zesítění, nukleární magnetické rezonance a fluorescenční spektroskopie. Na základě získaných dat z maloúhlového rozptylu rentgenového záření a chemického zesítění byl navrhnut model struktury komplexu katalytické domény proteinkinasy ASK1 s proteinem 14-3-3ζ, který ukazál, že tento komplex je v roztoku konformačně heterogenní. Tento strukturní model společně s daty z časově rozlišené fluorescence a nukleární magnetické rezonance částečně vysvětlují inhibiční mechanismus proteinu 14-3-3. Získané výsledky ukázaly, že protein 14-3-3ζ interaguje s katalytickou doménou ASK1 v těsné blízkosti aktivního místa, a proto by tato interakce mohla mít vliv na strukturu nebo...
|
|
|
Příprava lidské Ca2+/kalmodulin-dependentní proteinkinasy kinasy 2 fosforylované na Ser100 a Ser511
Koupilová, Nicola ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
4 Abstrakt Ca2+ /kalmodulin-dependentní proteinkinasa kinasy (CaMKK) jsou serin/threonin kinasy, které se účastní vápníkové signální dráhy, přičemž u savců byly popsány dvě isoformy CaMKK, CaMKK1 a CaMKK2. Při zvýšení intracelulární koncentrace vápenatých kationtů dochází k aktivaci CaMKK prostřednictvím vazby komplexu Ca2+ /kalmodulin na C-koncový segment CaMKK, což uvolní autoihibici přerušením interakcí autoinhibičního segmentu s aktivním centrem kinasy. Aktivované CaMKK následně fosforylují a aktivují proteinkinasy CaMK1 a CaMK4 a v případě CaMKK2 i AMPK. Aktivita CaMKK je dále regulována prostřednictvím fosforylace cAMP-dependentní proteinkinasou A (PKA). Tato fosforylace vytvoří dva vazebné motivy, které jsou rozpoznány regulačními proteiny 14-3-3. Předchozí studie ukázaly, že protein 14-3-3 udržuje fosforylovanou CaMKK1 v inhibovaném stavu tím, že blokuje defosforylaci inhibičního fosforylačního místa. Předpokládá se, že i CaMKK2 by mohla být regulována podobným způsobem. Nicméně úloha vazby proteinu 14-3-3 v regulaci CaMKK2 je nejasná. Pro studium tohoto komplexu je však nutné připravit rekombinantní CaMKK2, která bude plně fosforylována na obou 14-3-3 vazebných motivech. Hlavním cílem této bakalářské práce bylo optimalizovat protokol pro fosforylaci lidské CaMKK2 (rezidua 93-517) obsahující pouze...
|
|
|
Studium mechanismů regulace vybraných proteinkinas
Petrvalská, Olívia
Proteiny 14-3-3 skrze vazbu více než 300 vazebných partnerů regulují značné množství biologicky významných dějů, např. apoptosu, buněčný cyklus, přenos signálu či metabolické dráhy. V rámci této disertační práce byla studována úloha proteinů 14-3-3 v regulaci dvou vybraných proteinkinas ASK1 a CaMKK2. Hlavním cílem práce bylo pochopit strukturní podstatu mechanismů, kterými fosforylace a vazba proteinů 14-3-3 regulují aktivitu těchto proteinkinas pomocí různých biochemických a biofyzikálních metod, zejména metod bodové mutagenese, měření enzymové aktivity, analytické ultracentrifugace, maloúhlového rozptylu rentgenového záření, chemického zesítění, nukleární magnetické rezonance a fluorescenční spektroskopie. Na základě získaných dat z maloúhlového rozptylu rentgenového záření a chemického zesítění byl navrhnut model struktury komplexu katalytické domény proteinkinasy ASK1 s proteinem 14-3-3ζ, který ukazál, že tento komplex je v roztoku konformačně heterogenní. Tento strukturní model společně s daty z časově rozlišené fluorescence a nukleární magnetické rezonance částečně vysvětlují inhibiční mechanismus proteinu 14-3-3. Získané výsledky ukázaly, že protein 14-3-3ζ interaguje s katalytickou doménou ASK1 v těsné blízkosti aktivního místa, a proto by tato interakce mohla mít vliv na strukturu nebo...
|
|
|
Biofyzikální charakterizace N-koncové části proteinkinasy ASK1.
Honzejková, Karolína ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Proteinkinasa ASK1 (z anglického "apoptosis signal-regulating kinase 1") je apikální kinasa mitogeny aktivované proteinkinasové kaskády (tzv. MAPK kaskády). Její aktivita je spouštěna např. reaktivními formami kyslíku, cytokiny, stresem endoplasmatického retikula či osmotickým stresem. Aktivace ASK1 má za následek spuštění metabolických drah, na jejichž počátcích stojí mitogeny aktivované proteinkinasy (MAPK) p38 a c-Jun N-koncová kinasa (JNK). Aktivace těchto kinas vede k zánětu nebo smrti buňky. Dysregulace ASK1 je asociována s rozvojem patologických stavů, jakými jsou neurodegenerativní, kardiovaskulární či nádorová onemocnění, což z tohoto proteinu činí potenciální cíl terapeutických zásahů. Aktivita proteinkinasy ASK1 je regulována prostřednictvím protein-proteinových interakcí, mezi hlavní negativní regulátory ASK1 řadíme rodinu dimerních proteinů 14-3-3 a redoxní protein thioredoxin 1. Příkladem pozitivních regulátorů jsou faktory asociované s TNF receptorem. Kromě toho je aktivita ASK1 přísně regulována prostřednictvím oligomerizace. Navzdory neustálému pokroku, kterého je dosahováno v rámci studia tohoto proteinu, je přesný molekulární mechanismus regulace ASK1 a vliv oligomerizace na tento proces nejasný, částečně z důvodu nedostatku strukturních dat. Interakce N-koncových částí dvou...
|
host ::
RSS.