|
|
Cytogenetické metody v genotoxikologii
Bártů, Linda ; Daňková, Pavlína (vedoucí práce) ; Langová, Martina (oponent)
Každý den jsme vystaveni vlivu řady faktorů, které mohou působit jako mutageny na naši DNA. Věda zkoumající vliv takovýchto mutagenních faktorů, které mohou být fyzikálního, chemického i biologického původu, se nazývá genotoxikologie. Mezi fyzikální faktory patří v první řadě ionizující záření. Z chemických můžeme zmínit např. benzen či vinylchlorid nebo některé léky. Jako biologické mutagenní faktory mohou působit některé viry. Opravné mechanismy buňky, které opravují dvouvláknové zlomy DNA, se liší dle toho, jestli vyžadují rozsáhlé homologní sekvence (HRR) nebo naopak, zda se bez takovýchto sekvencí obejdou a vystačí si jen s krátkými homologními sekvencemi zahrnujícími několik málo bazí (NHEJ). Oba tyto mechanismy, pokud neproběhnou správně, mohou vést ke vzniku aberací chromosomů. Mezi získané chromosomové aberace patří translokace, vyskytující se často u nádorových buněk, delece, nebo například vznik acentrických fragmentů, dicentrických a prstencových chromosomů. Chromosomové aberace zahrnují chromatidové zlomy a chromatidové výměny. Metody pro vyšetření takovýchto změn je několik, mohou být rozděleny podle fáze, ve které se vyskytuje buňka v době vyšetření. Nejzákladnější metodou je klasické barvení Giemsou, které odhalí většinu aberací, kromě translokací a inverzí, a numerické odchylky...
|
|
| |
|
|
GENOTOXICITY OF NANOMATERIALS IN BEAS-2B CELLS ANALYZED BY THE IN VITRO MICRONUCLEUS ASSAY
Rössnerová, Andrea ; Červená, Tereza ; Brzicová, Táňa ; Vrbová, Kristýna ; Sikorová, Jitka ; Topinka, Jan ; Rössner ml., Pavel
The tremendous increase of the use of nanomaterials (NMs) has been witnessed during the last decade in many areas of human life including the chemical industry, cosmetics, biomedicine or food technology. The variety of NMs, their unique properties, almost ubiquitous presence and the size range of 1-100 nm raised the interest of toxicologists. The evaluation of the frequency of micronuclei (MN) as a result of the genotoxic events is a broadly utilized and well-established approach in in vitro studies for testing the risk of chemical exposure. Nevertheless, properties of the NMs give rise to the questions concerning the optimal methodological variants of the MN assay. \n\nIn our study, five types of well-characterized NMs (TiO2: NM-101 and NM-103, SiO2: NM-200, Ag: NM-300K and NM-302) of specific size, shape, or e.g. dimensions of aggregates were involved in the genotoxicity testing using four variants of protocols differing in the time of NM exposure, application of cytochalasin-B combined with simultaneous and delayed co-treatment with nanoparticles (NPs). Bronchial epithelial cells (BEAS-2B) were used in this study to fulfil these tasks. Presence of NPs was controlled by transmission electron microscopy (TEM). \n\nObtained results showed the different genotoxic potential of the various TiO2 and Ag NMs (NM-101< NM-103 and NM-300K> NM-302, respectively). Comparison of all testing strategies revealed, that the level of DNA damage can differ based on the time of exposure and the methodological approach. In general, using cytochalasin-B led most frequently to the increase of the genotoxic potential of the tested NMs.
|
|
|
PŘÍPRAVA A VYUŽITÍ VYBRANÝCH BIOPOLYMERŮ, NANOČÁSTIC A NANOVLÁKEN PRO KOSMETICKÉ A POTRAVINÁŘSKÉ ÚČELY
Bokrová, Jitka ; Pekař, Miloslav (oponent) ; Kráčmar, Stanislav (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Předložená dizertační práce je zaměřena na přípravu kombinovaných preparátů s přírodní aktivní složkou ve formě nanočástic a nanovláken a testování jejich biologických účinků. Moderní typy aplikačních forem byly připraveny z biomateriálů na bázi jednoho či více přírodních polymerů. Chitosanové částice byly připraveny metodou zesítění polymeru s využitím ultrasonikace. Pro přípravu liposomů byla použita směs sojového lecithinu a cholesterolu, v případě nového typu kombinovaných liposomů navíc biopolymer poly-3-hydroxybutyrát. Všechny liposomové částice byly rovněž připraveny metodou ultrasonifikace. Nanovlákna byla získána z polyhydroxybutyrátu s využitím elektrospinningu. Aktivní složkou preparátů byly směsi nízkomolekulárních látek získané extrakcí z přírodních zdrojů s vysokým obsahem antioxidantů. Jako zdroje aktivních látek byly zvoleny vzorky různých typů čajů a kůr, bylin, koření a také vzorky ovoce a zeleniny. U extraktů vzorků byl pomocí spektrofotometrických metod stanoven celkový obsahu polyfenolů, flavonoidů a celková antioxidační aktivita. Získané extrakty byly následně použity k enkapsulaci. Připravené kombinované preparáty byly charakterizovány z hlediska jejich fyzikálně-chemických vlastností. Velikost částic byla sledována s pomocí dynamického rozptylu světla. Koloidní stabilita částic v suspenzi byla stanovena pomocí zeta potenciálu. Ke stanovení účinnosti enkapsulace aktivní látky do částice byly použity spektrofotometrické metody. Morfologie nového typu kombinovaných liposomů byla sledována pomocí elektronové mikroskopie a pro kvantifikaci jednotlivých složek částic byly využity metody plynové i kapalinové chromatografie. Morfologie vláken a inkorporace aktivní složky do jejich struktury byla sledována s využitím FTIR-ATR spektroskopie a elektronové mikroskopie. Připravené preparáty byly následně hodnoceny z hlediska jejich antimikrobiálních, cytotoxických a genotoxických účinků. Bylo zjištěno, že nejvhodnějšími typy extraktů pro přípravu liposomových částic jsou vodné a lipidické extrakty zdrojů antioxidantů. Připravené částice vykazovaly výbornou stabilitu a dobrou enkapsulační účinnost. Rovněž bylo potvrzeno, že inkorporace polyhydroxybutyrátu nesnižuje koloidní stabilitu částice ani účinnost procesu enkapsulace. U připravených preparátů byl potvrzen antimikrobiální nebo antimykotický účinek proti testovacím mikroorganismům Micrococcus luteus, Serratia marcescens a Candida glabrata. Bylo zjištěno, že proces enkapsulace do částic zvyšuje inhibiční efekt samotných přírodních extraktů. Bezpečnost připravených preparátů byla testována s využitím dvou humánních buněčných kultur: epidermálních keratinocytů a buněčné linie HaCaT. Ke stanovení cytotoxicity byly použity jak metody stanovení metabolické aktivity buněk, tak metody sledující intaktnost plazmatické membrány. Pomocí série cytotoxických testů byla potvrzena nízká toxicita liposomových částic. Zkoumání účinků suspenze liposomů a kombinovaných PHB liposomů ukázalo, že spojení fosfolipidu s polymerem PHB nezpůsobuje výrazně vyšší hladinu cytotoxicity na lidských kožních buňkách. Testováním genotoxicity na modelovém mikroorganismu nebyl prokázán u připravených preparátů žádný genotoxický potenciál. Nový typ kombinovaných částic i polymerních vláken může být tedy použit jako cílený nosič pro aktivní složky jako jsou antioxidanty, komplexní přírodní extrakty, antimikrobiální činidla a mnoho dalších.
|
|
|
Ames test in the drug development
Klaučová, Martina ; Pávek, Petr (vedoucí práce) ; Konečná, Klára (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakológie a toxikológie Študentka: Martina Klaučová Školiteľ: prof. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D. Konzultant: PharmDr. Ivona Pávková, Ph.D. Názov diplomovej práce: Použitie Amesovho testu v štúdiu genotoxicity novo vyvíjaných látok Cieľ práce: Cieľom práce je stanovenie potenciálnej genotoxicity novo vyvíjaných látok v rámci základného testovania a zavedenie Amesovho mikroflukuačného testu do bežných laboratórnych podmienok. Metódy: V práci som použila komerčný kit založený na princípe Amesovho testu, ktorý farebnou zmenou avizuje reverznú mutáciu testovaného bakteriálneho kmeňa S. typhimurium. Naštudovala som si dostupnú literatúru a navrhla najvhodnejšie prevedenie mikrofluktuačného testu, prípravu chemikálií, uchovávanie kmeňov a následne test zaviedla do bežnej laboratórnej praxe. Výsledky: Z látok dodaných k otestovaniu pôsobia genotoxicky T6445 a T6447 v koncentrácii 30 µM testované s metabolickou aktiváciou S9 na kmeni ST TA 98. Látka UOCHB1 v koncentrácii 30 µM testovaná bez metabolickej aktivácie S9 vykazuje hraničnú pozitívnu reakciu na kmeňoch ST TA 98 aj ST TA 100. Ostatné vzorky toxicitu neprejavujú. V rámci zavádzania testu boli vyskúšané 3 rôzne postupy, z ktorých najvhodnejším sa zdá byť test za využitia farebného...
|
|
|
Ames test in the drug development
Klaučová, Martina ; Pávek, Petr (vedoucí práce) ; Konečná, Klára (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra farmakológie a toxikológie Študentka: Martina Klaučová Školiteľ: prof. PharmDr. Petr Pávek, Ph.D. Konzultant: PharmDr. Ivona Pávková, Ph.D. Názov diplomovej práce: Použitie Amesovho testu v štúdiu genotoxicity novo vyvíjaných látok Cieľ práce: Cieľom práce je stanovenie potenciálnej genotoxicity novo vyvíjaných látok v rámci základného testovania a zavedenie Amesovho mikroflukuačného testu do bežných laboratórnych podmienok. Metódy: V práci som použila komerčný kit založený na princípe Amesovho testu, ktorý farebnou zmenou avizuje reverznú mutáciu testovaného bakteriálneho kmeňa S. typhimurium. Naštudovala som si dostupnú literatúru a navrhla najvhodnejšie prevedenie mikrofluktuačného testu, prípravu chemikálií, uchovávanie kmeňov a následne test zaviedla do bežnej laboratórnej praxe. Výsledky: Z látok dodaných k otestovaniu pôsobia genotoxicky T6445 a T6447 v koncentrácii 30 µM testované s metabolickou aktiváciou S9 na kmeni ST TA 98. Látka UOCHB1 v koncentrácii 30 µM testovaná bez metabolickej aktivácie S9 vykazuje hraničnú pozitívnu reakciu na kmeňoch ST TA 98 aj ST TA 100. Ostatné vzorky toxicitu neprejavujú. V rámci zavádzania testu boli vyskúšané 3 rôzne postupy, z ktorých najvhodnejším sa zdá byť test za využitia farebného...
|
|
|
Vliv vybraných superpotravin a jejich složek na lidské buňky
Maslonková, Ivana ; Skoumalová, Petra (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Predložená diplomová práca sa zameriava na charakterizáciu zloženia a biologických účinkov vybraných druhov superpotravín. V teoretickej časti sú uvedené základné informácie o použitých superpotravinách a ich bioaktivných látkach, ktoré sú predmetom záujmu v experimentálnej časti. Ďalej sú v teoretickej časti popísané základne vezikulárne systémy, ktoré boli použité na enkapsuláciu extraktov a metódy ich štúdia. Taktiež bola spracovaná krátka rešerš o bunkových kultúrach a ich kultivácii a prehľad najpoužívanejších metód stanovovania cytotoxicity a genotoxicity. V experimentálnej časti boli pripravené vodné a etanolové extrakty vybraných superpotravín. Extrakty boli ďalej enkapsulované do lipozomálnych a kombinovaných PHB častíc. Extrakty potravín boli popísané spektrofotometrickými metódami, pomocou ktorých sa stanovil obsah polyfenolov, flavonoidov, antokyánov, karoténov, chlorofylu, trieslovín a určila sa antioxidačná aktivita. Taktiež sa stanovili základné fyzikálno-chemické parametre pripravených lipozomálnych a kombinovaných častíc. Pripravené častice a v nich enkapsulované vyextrahované látky sa ďalej testovali pomocou MTT testu a SOS chromotestu, kedy sa určil ich cytotoxický a genotoxický charakter.
|
|
|
Využití buněčné linie BEAS-2B pro analýzu mikrojader v genetické toxikologii
Červená, Tereza ; Rössner, Pavel (vedoucí práce) ; Rubeš, Jiří (oponent)
Práce se zabývá využitím buněčné linie BEAS-2B pro analýzu mikrojader v genetické toxikologii. Je rozdělena do dvou hlavních částí: a) teoretický úvod do problematiky analýzy a hledání vhodných modelů pro testování vlivu znečištěného ovzduší a vyráběných nanočástic, b) praktická část popisující výsledky analýzy mikrojader indukovaných polycyklickými aromatickými uhlovodíky (PAU), extrahovatelnou organickou hmotou (EOM) ze spalin tří typů dieselového paliva a vyráběných nanočástic. Buněčná linie BEAS-2B představuje nenádorový model lidského plicního epitelu, který se jeví jako vhodný pro analýzu mikrojader. Tato analýza je běžně používaným postupem pro stanovení genotoxicity látek, který se používá u širokého spektra buněčných kultur a také v lidských studiích. V rámci této diplomové práce byly po dobu 28, 48 a 72 hodin testovány následující látky: benzo[a]pyren, 3-nitrobenzantron a 1-nitropyren jakožto karcinogenní PAU běžně se vyskytující ve znečistěném ovzduší; EOM ze spalin 100% nafty, nafty s 30% přídavkem biosložky, 100% bionafty a dvě vyráběné nanočástice TiO2 a Ag. Výsledky práce potvrzují vhodnost zvolené buněčné linie jako modelového systému pro stanovení genotoxicity testovaných látek při využití specifických kultivačních podmínek zajišťujících stabilitu linie BEAS-2B. Práce současně...
|
|
|
Vztah mezi genetickými polymorfismy DNA reparačních genů a jejich expresí u zdravé populace (s výhledem na stanovení u onkologických pacientů).
Hánová, Monika ; Vodička, Pavel (vedoucí práce) ; Bencko, Vladimír (oponent) ; Černá, Marie (oponent)
Odpověď na poškození DNA je komplexní systém, odpovědný za ochranu buňky proti vnitřním a vnějším vlivům poškozujícím DNA a za udržování integrity genomu. Mnoho genů, které se účastní signálních drah reagujících na poškození DNA, je polymorfních. Genetické polymorfismy v kódujících a regulačních oblastech mohou mít vliv na funkci proteinů, které tyto geny kódují. Fenotypový efekt jednonukleotidových polymorfismů (SNPs), je předmětem zkoumání v souvislosti se schopností buňky zvládat genotoxický stres a následně ve vztahu k riziku vzniku onkologického onemocnění. Cílem této práce bylo zhodnotit vztah mezi SNPs v genech zodpovědných za opravy poškození DNA (hOGG1, XRCC1, XPC) a genech buněčného cyklu (TP53, p21CDKN1A , BCL2 a BAX) a expresí na úrovni mRNA v lymfocytech periferní krve u subjektů exponovaných styrenu v pracovním prostředí a u kontrolních subjektů. Cíl byl rozšířen na analýzu vztahu mezi expresí uvedených genů na úrovni mRNA a markery expozice styrenu (koncentrace styrenu v krvi a ve vzduchu), markery poškození DNA (jednořetězcové zlomy - SSBs; místa specifická pro endonukleázu III - Endo III místa) a kapacitou bázové excizní opravy (BER) měřené pomocí míry opravy poškození DNA způsobeného γ-zářením a schopností opravovat oxidativní poškození. Studie na skupině zdravých jedinců...
|
|
|
Využití buněčných kultur k testování přírodních látek rostlinného původu
Ručková, Michaela ; Kostovová, Iveta (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Předložená práce se zabývá přípravou vodných a olejových extraktů rostlinného původu, jejich charakterizací a testováním cytotoxicity a genotoxicity. V teoretické části byla vypracována rešerše zaměřená na základní informace o použitých rostlinách a druzích koření nebo čaje. Dále byla popsána použitá metoda přípravy lipozomů a enkapsulace účinných látek, stanovení antioxidační aktivity, charakterizace částic, kultivace buněčných kultur a princip použitých testů cytotoxicity a genotoxicity. Rostlinné extrakty byly spektrofotometricky stanoveny na obsah polyfenolů a flavonoidů a byla změřena jejich antioxidační aktivita. Do lipozomů vytvořených metodou ultrazvukové homogenizace byly enkapsulovány aktivní látky z extraktů, byla stanovena enkapsulační účinnost, a také dlouhodobá stabilita těchto složek. Metodou DLS byla určena velikost připravených lipozomů a změřením zeta potenciálu jejich stabilita. Nezbytnou součástí práce byla kultivace humánních keratinocytů. Byl proveden MTT test cytotoxicity na buněčné kultuře a SOS Chromotest genotoxicity na modelovém organismu geneticky upravené E. coli. Na závěr bylo navrženo možné použití připravených lipozomů v kosmetickém či farmaceutickém průmyslu.
|
host ::
RSS.