|
|
Identification of new neuroactive steroids that are able to interact with allosteric binding sites on purinergic P2X receptors
Sivčev, Sonja ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Vyklický, Vojtěch (oponent) ; Stojilkovic, Stanko S. (oponent)
(CZ) Purinergní P2X receptory jsou ATP-aktivavané iontové kanály, které mají mnoho fyziologických rolí a nově představují důležité terapeutické cíle v řadě nemocí. P2X podjednotky se skládají ze dvou transmembránových α-helixů (TM1 a TM2), extracelulární ATP-vazebné domény a intracelulárních N- a C- konců. Sedm různých P2X podjednotek (P2X1-7) se může složit a vytvořit homotrimérní nebo heterotrimérní iontové kanály propustné pro monovalentní kationty a vápník. P2X receptory se vyskytují prakticky ve všech tkáních, v mozku mají největší zastoupení podjednotky P2X2, P2X4 a P2X7. Aktivita P2X nezávisí jen na přítomnosti ATP, ale také alosterických modulátorů, které mohou inhibovat nebo zvyšovat aktivitu těchto kanálů. Našim cílem bylo identifikovat nové molekuly, které mohou interagovat s alosterickými vazebnými místy na P2X receptorech, navrhnout a syntetizovat nové analogy neurosteroidů a určit kritické receptorové domény nebo aminokyseliny, které jsou důležité pro vazbu neurosteroidu. Pomocí patch-clamp elektrofyziologické techniky jsme snímali ATP- evokované proudy z HEK293T buněk transfekovaných potkaními P2X2, P2X4 a P2X7, a z buněk předního laloku hypofýzy nebo hypotalamických neuronů, které tyto receptory přirozeně exprimují. Nalezli jsme, že 17β-ester deriváty testosteronu, především...
|
|
|
Objemové změny u astrocytů v průběhu ischemického poškození mozku
Mikešová, Michaela ; Anděrová, Miroslava (vedoucí práce) ; Zemková, Hana (oponent)
Ischemické poškození mozku je souborem patofyziologických dějů, které nastávají po přechodné nebo trvalé redukci průtoku krve mozkovou tkání. Dochází při něm k narušení funkce neuronů a astrocytů, při delším trvání i k jejich zániku. V poslední době se výzkum stále více zaměřuje na astrocyty, které se zdají být klíčovou složkou určující další přežívání buněk v průběhu ischemie, včetně neuronů. Astrocyty zastávají řadu důležitých funkcí, například udržování iontové homeostázy, prevence excitotoxicity, odstraňování volných radikálů a další. V důsledku toho mohou astrocyty v průběhu ischemie výrazně zvětšit svůj objem a přispět tak značnou měrou ke vzniku cytotoxického edému v mozku. Edém komplikuje jak průběh, tak léčbu ischemie, a proto je předmětem zájmu současné vědy. Tato práce obsahuje přehled mechanismů, které mohou přispívat ke zvětšování objemu astrocytů v průběhu ischemického poškození mozku a dále popisuje metody umožňujících kvantifikaci a studium objemových změn astrocytů. Vzhledem k tomu, že edém výrazně komplikuje jak průběh, tak léčbu ischemie, objasnění mechanizmů vedoucích ke zvětšování objemu astrocytů a jeho regulaci v průběhu ischemie/reperfúze může být využito k navržení nových terapeutických postupů vedoucích ke zmírnění negativního dopadu edému.
|
|
|
Úloha deseti ektodoménových cysteinových zbytků ve funkci P2X4 receptoru stimulovaného ATP
Tvrdoňová, Vendula ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Teisinger, Jan (oponent)
Mimobuněčný adenosin-5'-trifosfát (ATP), uvolňovaný z poškozených buněk nebo sekretovaný ze synaptických váčků, působí na své membránové receptory nazývané purinergní. Purinergní P2X receptory jsou iontové kanály aktivované ATP. Dosud bylo u savců identifikováno sedm P2X podjednotek, označených jako P2X1-7. Všechny podjednotky mají podobnou strukturu, kterou tvoří velká ektodoménová klička, dvě transmembránové domény a vnitrobuněčné N- a C- konce. Dalším společným rysem jsou konzervované aminokyseliny, mezi něž patří i deset cysteinových zbytků v ektodoménové kličce. Všechny ektodoménové cysteiny tvoří disulfidické můstky, které jsou uspořádány do dvou polovin, tři disulfidické můstky jsou v N-koncové části a dva jsou v C-koncové části ektodomény. P2X receptory jsou organizovány jako homoméry nebo heteroméry tří podjednotek. ATP vazebná kapsa se nachází mezi dvěmi sousedními podjednotkami. Cílem diplomové práce bylo prozkoumat úlohu ektodoménových cysteinů nebo disulfidických můstků ve funkci a tvorbě P2X4 receptoru a jeho citlivosti k ATP. Všech deset cysteinů, jeden po druhém, bylo nahrazeno alaniny a ATP-stimulované proudy byly snímány z HEK293 buněk nesoucích divoký typ P2X4 receptoru a jeho mutanty. Pro další výzkum nefunkčních nebo málo funkčních mutací (C126A, C149A, C217A, C227A, C270A) byl...
|
|
| |
|
| |
|
|
Úloha transmembránových domén ve struktuře a funkci P2X receptorů
Jindřichová, Marie ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Langmeier, Miloš (oponent) ; Martásek, Pavel (oponent)
Purinergní P2X receptory, aktivované extracelulárním ATP (adenosin-5'- trifosfátem), reprezentují nový strukturální typ ligandem otevíraných iontových kanálu. V excitabilních i neexcitabilních tkáních bylo doposud nalezeno sedm podtypu P2X receptoru. S novými poznatky o fyziologických úcincích extracelulárního ATP a roli jednotlivých P2X podtypu dramaticky roste zájem o podrobné studium P2X receptoru. Je známo, že purinergní signalizace má významnou úlohu v prenosu bolesti, poranení CNS a v imunitních procesech. Málo se však ví o molekulární strukture P2X receptoru, mechanismu otevírání a zavírání iontového kanálu, lokalizaci P2X receptoru a zpusobu ukoncení pusobení ATP prostrednictvím ektonukleotidáz. V prípade detailní znalosti techto mechanismu a znalosti struktury P2X proteinu se otevírá možnost vývoje nových léciv napríklad v oblasti chronické bolesti. Cílem této práce je shrnout nové poznatky v oblasti P2X signalizace a popsat náš podíl v objasnení struktury P2X receptoru. Byla studována sekundární struktura transmembránových domén P2X4 receptoru, hlavního P2X podtypu v CNS, mechanismus otevírání a uzavírání iontového kanálu a citlivost receptoru k agonistum a alosterickému modulátoru ivermektinu. K identifikaci aminokyselin, které mohou hrát roli v techto funkcích, byla provedla skenovací mutagenezi...
|
|
|
Studium farmakologie a funkce vazebných míst nikotinových acetylcholinových receptorů
Kaniaková, Martina ; Krůšek, Jan (vedoucí práce) ; Chaloupka, Roman (oponent) ; Zemková, Hana (oponent)
Název práce: Studium farmakologie a funkce vazebných míst nikotinových acetylcholinových receptorů Autor: Mgr. Martina Kaniaková Katedra / Ústav: Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. Vedoucí disertační práce: RNDr. Jan Krůšek, CSc., Fyziologický ústav AV ČR, v.v.i. Abstrakt: Nikotinové acetylcholinové receptory (nAChR) jsou ligandem otevírané iontové kanály. Jejich funkční vlastnosti a možnosti farmakologického ovlivnění jsme studovali prostřednictvím techniky terčíkového zámku (patch-clamp) v konfiguraci měření proudu z celé buňky. Zkoumali jsme vlastnosti neuronálních receptorů heterologně exprimovaných v linii COS buněk a svalových receptorů přirozeně exprimovaných buněčnou linií TE671. Lobelin, rostlinný alkaloid s dlouholetou historií terapeutického využití, je schopen přímé interakce s nikotinovými acetylcholinovými receptory ve vazebném místě pro agonistu. Zjistili jsme, že výsledný účinek této interakce je závislý na aplikované koncentraci lobelinu, přítomnosti dalšího agonisty, časovém schématu aplikace a v neposlední řadě na podtypu receptoru. Souhrnně lze lobelin označit za velmi slabého parciálního agonistu nAChR s výraznou schopností desensitizovat některé podtypy receptorů. V kombinaci s jinými agonisty lobelin účinkuje buď jako kompetitivní antagonista nebo koagonista. Pomocí bodových mutací jsme...
|
|
|
Spontánní vápníková propustnost iontového kanálu P2X receptoru po záměně konzervovaného tyrosinu v 1 . transmembránové doméně
Rupert, Marian ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Balík, Aleš (oponent)
Purinergní P2X receptory jsou membránové iontové kanály, které jsou aktivované extracelulárním ATP. U obratlovců kóduje podjednotky P2X receptorů sedm genů. Podjednotky, označované P2X1 - 7, mají 40 - 50 % shodných aminokyselinových sekvencí. P2X receptory se skládají ze tří podjednotek a ve tkáních obratlovců se vyskytují jako homo- nebo heterotrimery. P2X receptory mají v organismu širokou distribuci, funkční receptory byly nalezeny v neuronech, gliových buňkách, svalových buňkách a také v neexcitabilních tkáních, jako jsou epitely, endotely a hemopoietické tkáně. Purinergní signalizace má významnou úlohu v přenosu bolesti, při poranění CNS a v imunitních procesech. Podjednotka P2X receptoru se skládá ze dvou transmembránových domén, extracelulární domény a intracelulárních N- a C- konců. Každá transmembránová doména obsahuje dvě aminokyseliny konzervované napříč všemi P2X podjednotkami. V první transmembránové doméně receptoru P2X2 jsou to Gly30 a Tyr43 . V předchozích experimentech bylo elektrofyziologickými měřeními prokázáno, že u receptoru P2X2 po záměně konzervovaného Tyr43 v první transmembránové doméně za alanin dochází k prodloužení doby deaktivace iontového kanálu po odmytí agonisty. Tato práce je zaměřena na objasnění role konzervovaného tyrozinu v procesu otvírání a zavírání iontového...
|
|
|
Výskyt a úloha purinergního P2X7 receptoru v imunitním systému
Piskačová, Kateřina ; Zemková, Hana (vedoucí práce) ; Červená, Kateřina (oponent)
V současné době se ukazuje, že extracelulární ATP a jeho metabolit adenosin představují klíčové mediátory v imunitním systému. V závislosti na koncentraci může ATP působit jako aktivátor nebo inhibitor imunitní odpovědi, zatímco o adenosinu je všeobecně známo, že působí jako účinný imunosupresor. Signalizace extracelulárního ATP je detegována a přenášena purinergními P2- a adenosinová signalizace P1- receptory. V podstatě všechny buňky imunitního systému nesou na své plazmatické membráně P2X, P2Y a adenosinové P1 receptory, proto purinergní signalizace zasahuje do všech složek imunitních a zánětlivých reakcí, včetně neurodegenerativních onemocnění. Toto poznání vyvolalo vlnu zájmu o výzkum, vývoj a syntézu nových látek působících na P1- a P2-receptory, které by mohly pomoci při léčbě chronických zánětlivých a neurodegenerativních onemocnění. Tato bakalářská práce se pokusí shrnout nejnovější poznatky o úloze P2X7 receptoru v těchto procesech. Tento podtyp P2-receptoru je výjimečný tím, že je zapojen do uvolňování cytokinů z imunitních buněk a hraje roli v buněčném růstu a apoptóze.
|
|
|
Exprese podjednotek AMPA glutamátových receptorů v suprachiasmatickém jádře potkana
Červená, Kateřina ; Bendová, Zdeňka (vedoucí práce) ; Zemková, Hana (oponent)
Hlavní cirkadiánní pacemaker savců uložený v suprachiasmatických jádrech hypotalamu (SCN), je adaptován ke změnám ve vnějším prostředí synchronizací své endogenní periody střídáním světla a tmy během dne a noci. Informace o světle putuje glutamátergním retinohypotalamickým traktem do ventrolaterální části SCN. Aktivace ionotropních glutamátových receptorů v této oblasti prokazatelně zprostředkovává přenos informace o světle na transkripční aparát světloreaktivních buněk. Hojně prozkoumané jsou receptory typu NMDA, jejichž některé podjednotky vykazují v SCN cirkadiánní rytmus a zvýšenou expresi po světelném pulzu. AMPA signalizace v SCN je daleko méně prozkoumaná. Cílem této práce bylo určit, které podjednotky AMPA receptorů jsou exprimovány v SCN potkana, zda tyto podjednotky vykazují denní rytmus a reaktivitu na světelný pulz a nastínit, jaké různé úlohy mohou jednotlivé receptory typu AMPA v SCN plnit. Klíčová slova: cirkadiánní rytmy, suprachiasmatická jádra, glutamátové receptory, AMPA
|
host ::
RSS.