|
| |
|
|
Studies on carbonyl reductases 1 and 3 variants with emphasis on S-nitrosoglutathione as substrate and inactivator
Hartmanová, Tereza ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
Universita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Tereza Hartmanová Školitel: Dr. Claudia Staab, Dr. Hans-Jörg Martin, Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Studium mutací karbonylreduktasy 1 a 3 s důrazem na S-nitrosoglutathion jako substrát a inaktivátor Lidské CBR1 a CBR3 (karbonylreduktasa 1 a 3) jsou monomerní, na NADPH závislé enzymy patřící do nadrodiny dehydrogenas/reduktas s krátkým řetězcem. Přestože na aminokyselinové úrovni si jsou oba enzymy velmi podobné (72 % shoda), v substrátové specifitě vykazují značné rozdíly. Substráty CBR1 jsou velmi dobře popsány. Zahrnují řadu látek jako endogenní indol isatin, S-nitrosoglutathion (GSNO), prostaglandiny, chinony a mnoho xenobiotik, které obsahují karbonylovou skupinu. Na rozdíl od CBR1 je výčet substrátů CBR3 mnohem menší a různorodý a role CBR3 stále není plně objasněna. Přesto tyto odlišnosti v substrátové specifitě naznačují rozdílné metabolické role. V této práci byly studovány katalytické vlastnosti CBR1 a jejího posledního popsaného substrátu, GSNO. Možné domněnky, že CBR3 by mohla také redukovat GSNO nebyly in vitro potvrzeny. Proto, k odhadnutí aminokyselin a mechanismů zodpovědných za vlastnosti CBR1, byly určité aminokyseliny v sekvenci CBR3 změněny tak, aby...
|
|
|
Vliv inhibice bosutinibu, neratinibu a ibrutinibu na aktivitu vybraných reduktas z nadrodiny AKR a SDR
Hudáčová, Lenka ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Hofman, Jakub (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Lenka Hudáčová Školiteľ: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Názov diplomové práce: Vliv inhibice bosutinibu, neratinibu a ibrutinibu na aktivitu vybraných reduktaz z nadrodiny AKR a SDR Antracyklínové antibiotiká (ANT) patria do skupiny antineoplastických liekov. Radíme k nim daunorubicin (DAUN), ktorý sa používa k liečbe akútnej leukémie. Enzýmy nadrodín aldo-ketoreduktáz (AKR) a reduktáz/dehydrogenáz s krátkym reťazcom (SDR) redukujú DAUN na príslušný C-13 alkohol daunorubicinol (DAUNOL), ktorý má vyššiu kardiotoxickú, menšiu antineoplastickú aktivitu a podieľa sa tak na vzniku antracyklínovej rezistencie. Hlavným cieľom predkladanej diplomovej práce bolo stanoviť potenciálne inhibičné účinky bosutinibu, neratinibu a ibrutinibu na aktivitu enzýmov z nadrodín SDR a AKR. K stanoveniu špecifickej aktivity enzýmov a inhibičných účinkov sme využili systém ultra vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie (UHPLC), v ktorom sme stanovili produkt in vitro enzýmovej reakcie (DAUNOL). K stanoveniu cytotoxických účinkov DAUN a ibrutinibu na bunkové línie HCT 116 sme použili MTT test. In vitro nameraná špecifická aktivita rekombinantných enzýmov klesala v poradí CBR1 > AKR1C3 > AKR1B1 > AKR1A1 > AKR7A2 > AKR1B10 >...
|
|
|
Production and purification of recombinant human xenobiotic nuclear receptors
Menclová, Alena ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Pávek, Petr (oponent)
Předložená diplomová práce se zabývá produkcí a purifikací rekombinantních lidských xenobiotických jaderných receptorů (NRs). Důraz je kladen na ligand- vazebnou doménu (LBD) lidského konstitutivního androstanového receptoru (hCAR) a lidského pregnanového X receptoru (hPXR). Tyto receptory patří do podskupiny NR1I jaderných receptorů a slouží k regulaci metabolismu léčiv. Významnou roli hrají u mnoha lidských nemocí, jako je zánětlivé onemocnění střev nebo diabetes a obezita. V rámci práce byly cDNA rekombinantních proteinů sloužící pro produkci hCAR a hPXR LBD klonované do bakteriálního expresního vektoru pET-15b od Novagenu. Získané plasmidy byly pomnoženy v kompetetivních buňkách E. coli kmene DH5. K ověření správnosti vložených inzertů sloužila technika PCR a restrikční analýza velikosti fragmentů na agarózových gelech. Vhodné izolované klony byly následně transformovány do kompetetivních buněk E. coli kmene BL21 DE3 a rekombinantní protein byl připraven za optimálních podmínek v expresním systému za použití regulace pomocí koncentrace isopropyl-1-thio--D- galactopyranosidu (IPTG). Produkce hCAR LBD a hPXR LBD byla sledována při definovaných koncentrací IPTG, teplotě a buněčné hustotě (OD600). Z výsledků vyplynuly optimální podmínky pro proteinovou produkci; hCAR LBD byla dosažena při 0.75 mM...
|
|
|
Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C3
Dudová, Radka ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Dudová Radka Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1C3 Purifikace vektoru pOTB7 s kódovou sekvencí aldo-ketoreduktasy 1C3 ( AKR1C3 ) v buňkách Escherichia coli byla provedena metodou alkalické lýze. Kódová sekvence byla následně amplifikována polymerasovou řetězovou reakcí. Správnost výsledku provedeného kroku byla prokázána ověřením velikosti nasyntetizovaného fragmentu a restrikční analýzou s restrikční endonukleasou PvuII. V druhém kroku byla kódová sekvence ligována do vektoru Topo 2.1, který byl transformován do kompetentních buněk E. coli. Buňky byly namnoženy a vektor Topo 2.1 s vloženou kódovou sekvencí byl získán metodou alkalické lýze. Výsledek byl ověřen porovnáním velikosti vektoru Topo 2.1 bez vloženého insertu a vektoru Topo 2.1 s kódovou sekvencí na agarózovém gelu a následnou restrikční analýzou s restrikční endonukleasou HindIII. Kódová sekvence byla ověřena metodou sekvenace. Dále byla provedena subklonace kódové sekvence z vektoru Topo 2.1 do expresního vektoru pET-15b. Úspěšnost subklonace byla ověřena porovnáním velikosti prázdného pET-15b a vektoru s vloženou sekvencí. V posledním kroku byl vytvořen...
|
|
|
Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1B1
Lundová, Tereza ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Zemanová, Lucie (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Tereza Lundová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Klonování, exprese a purifikace lidské AKR1B1 Aldosareduktasa (EC 1.1.1.21) AKR1B1 je jedním ze 13 lidských enzymů z AKR nadrodiny. Všechny lidské AKR jsou cytosolické a NADP(H) dependentní. AKR1B1 hraje důležitou roli v metabolismu endogenních i exogenních látek. Hlavním endogenním substrátem je glukosa. Její redukce na sorbitol je důsledně spojena se sekundárními diabetickými komplikacemi. Z xenobiotik je metabolizován pomocí AKR1B1 daunorubicin, protinádorové léčivo ze skupiny antracyklinů, které je redukováno na daunorubicinol. Tento metabolit je méně aktivní než původní léčivo a je příčinou antracyklinem způsobené kardiotoxicity. V současnosti je mnoho projektů zaměřených na zkoumání AKR1B1 jako cílového enzymu a hledání specifických inhibitorů. Rekombinantní protein byl připraven v E. coli společně s pET-28b(+) expresním vektorem. Nejprve byla izolována z E. coli cDNA pro AKR1B1 v pOTB7. Kódová sekvence AKR1B1 byla namnožena pomocí PCR. PCR byla provedena s Phusion Hot Start II polymerasou a párem forward a reverse primerů, které obsahují restrikční místa pro NdeI a XhoI. Jako vektor byl použit plasmid pET-28b(+)....
|
|
|
Inhibiční studie lidské membránově vázané karbonylreduktasy
Laštovková, Linda ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Mgr. Linda Laštovková Supervisor: prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Title of thesis: Inhibition study of human membrane-bound carbonyl reductase. Carbonyl reductases are an important group of enzymes that participate in metabolism of both endogenous substances also xenobiotics. Potential anticancer drug oracin is one of such xenobiotics that is metabolised by various carbonyl reductases to two enantiomers of dihydrooracin. The new human microsomal carbonyl reductase also takes part in biotransformation of oracin. This enzyme was recently purified on Department of biochemical sciences (Faculty of Pharmacy in Hradec Králové). The aim of this study was to find some inhibitors of the new enzyme and distinguish it in terms of inhibitors from another microsomal carbonyl reductase 11β-hydroxysteroid dehydrogenase 1. Flavonoids are substances produced by plants, they have a different both positive and also negative effect on human organism. One of such effect is inhibition effect on diverse enzymes. Carbonyl reductases also fall in this group. It has been described inhibitory effect of different flavonoids on carbonyl reductases. Inhibition study of the new human micorosomal carbonylreductase was...
|
|
|
Vývoj a aplikace afinitního nosiče pro izolaci lidských karbonyl-redukujících enzymů
Andrýs, Rudolf ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Šebela, Marek (oponent) ; Šatínský, Dalibor (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Mgr. Rudolf Andrýs Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název disertační práce: VÝVOJ A APLIKACE AFINITNÍHO NOSIČE PRO IZOLACI LIDSKÝCH KARBONYL-REDUKUJÍCÍCH ENZYMŮ Již po několik tisíciletí tvoří základ lidské medicíny malé bioaktivní molekuly, které byly podávány ve formě rostlinných extraktů nebo syntetický připravených sloučenin. Jejich využití v moderní lékařské vědě ovšem není možné bez detailního porozumění jejich biochemických účinků a identifikace jejich molekulárních cílů. Metody chemické proteomiky, založené na specifické interakci mezi bioaktivní látkou a cílovou molekulou, patří v současné době k nejpoužívanějším technikám při identifikaci molekulárních cílů malých molekul. Oproti klasickým biochemickým metodám (např. 2D elektroforéza) se jedná o citlivé a především velmi selektivní techniky, díky kterým lze z komplexních biologických vzorků úspěšně identifikovat i biomolekuly, které se přirozeně vyskytují jen ve velmi malých koncentracích. Takovými biomolekulami jsou i karbonyl-redukující enzymy, které představují fyziologicky důležitou skupinu proteinů, jelikož se podílí na metabolismu řady endogenních (např. prostaglandiny, steroidní hormony) i xenobiotických (např....
|
|
|
The impact of inflammation on muscarinic receptor subtypes expression - Immunohistochemical examination of lacrimal and salivary glands of rat and human
Székelyová, Anita ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Soukup, Ondřej (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Anita Székelyová Školitel: Prof. Gunnar Tobin, O.D., Ph.D. Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Vliv zánětu na expresi podtypů muskarinových receptorů - Imunohistochemie slzních a slinných žláz potkana a člověka Tento projekt byl zaměřený na charakterizaci exprese podtypů muskarinových receptorů v slzních a slinných žlázách potkana. K odhalení přítomnosti M1, M3 a M5 receptorů byly využity imunohistochemické metody a exprese těchto podtypů byla dále studována při experimentálně navozeném zánětu. Exprese výše zmiňovaných podtypů muskarinových receptorů byla taktéž studována v lidských pyskových žlázách zdravých a postižených autoimunitní sialadenitídou kompatibilní se Sjögrenovým syndromem. Muskarinové receptory M1, M3 a M5 byly nalezeny v slzních a podčelistních žlázách potkana s využitím imunoenzymové a imunofluorescenční metody. M5 receptor byl v slzní žláze detekován v nitrobuněčném, eventuálně jaderném umístění. Tkáň s navozeným zánětem nevykazovala žádné významné změny v expresi muskarinových receptorů. Imunofluorescenční značení M1 receptoru v lidských pyskových žlázách se Sjögrenovým syndromem naznačilo mírnou down-regulaci tohoto podtypu. M3 receptor byl up-regulovaný,...
|
|
|
Optimalizace purifikace lidské membránově vázané karbonylreduktasy
Andrýs, Rudolf ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Bílková, Zuzana (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Rudolf Andrýs Vedoucí práce: prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Optimalizace purifikace lidské membránově vázané karbonylreduktasy Enzymy redukující karbonylové skupiny se účastní metabolismu mnohých endogenních i exogenních látek. Většina dosud popsaných enzymů účastnících se metabolismu xenobiotik je cytosolických, jediným takovým zatím známým mikrosomálním enzymem je 11β-hydroxysteroiddehydrogenasa 1 (11β-HSD1). Podílí se také na metabolismu oracinu, prochirálního protinádorového léčiva, které je redukováno na (+) a (-) 11-dihydrooracin (DHO). Na základě rozdílů stereospecifit mezi lidskou mikrosomální frakcí a 11β-HSD1 se předpokládá podíl dalšího mikrosomálního enzymu na biotransformaci oracinu. Cílem této práce je potvrzení přítomnosti a purifikace tohoto nového lidského mikrosomálního enzymu. Lidské jaterní mikrosomy byly solubilizovány a odsoleny. Jako první purifikační krok byla využita Q-sepharosa. Vybraná frakce Q2, získaná touto metodou, byla podrobena druhému purifikačnímu kroku na Phenyl-sepharose. Jedna ze získaných frakcí splňující požadavky byla dále přečištěna gelovou filtrací. Ve všech frakcích získaných během purifikace byla stanovena redukční aktivita vůči...
|
host ::
RSS.