|
| |
|
|
Purifikace a charakterizace membránově vázané reduktasy z lidské jaterní tkáně
Pelcová, Vendula ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Mgr. Vendula Pelcová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název rigorózní práce: Purifikace a charakterizace membránově vázané reduktasy z lidské jaterní tkáně. Tato práce byla zaměřena na zavedení experimentálních technik pro purifikaci lidské jaterní mikrosomální frakce. Byly zvoleny tři základní kroky purifikačního schématu. Jako první krok byla zařazena iontově výměnná chromatografie na silném anexu následována dvěma separacemi na koloně pro gelovou filtraci. Před purifikací bylo nutno mikrosomální frakci solubilizovat, aby se uvolnily proteiny z vazby na membránu a podmínky optimalizovat. Jednotlivé najímané frakce byly následně inkubovány se specifickým substrátem reduktas oracinem a množství vzniklého metabolitu 11-dihydrooracinu bylo stanoveno pomocí achirální HPLC analýzy. U nejaktivnějších frakcí byla provedena SDS- PAGE a určena velikost hledaného enzymu. Použitím protilátky na 11beta-HSD1 byla vyloučena přítomnost této reduktasy v analyzovaných frakcích. S využitím popsaných purifikačních technik se podařilo zakoncentrovat frakci s dosud nepopsanou lidskou jaterní reduktasou.
|
|
|
Studium rezistence v nádorové terapii - vliv inhibitorů protein kinas na aktivitu vybraných lidských reduktas II.
Flaxová, Michaela ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Michaela Flaxová Školitel: prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Studium rezistence v nádorové terapii - vliv inhibitorů protein kinas na aktivitu vybraných lidských reduktas II. Nádorová onemocnění jsou v dnešní době velkým problémem, incidence se meziročně stále zvyšuje. Antracyklinová antibiotika mají důležité postavení v terapii nádorových onemocnení, bohužel jejich závažné nežádoucí účinky a léková rezistence často negativně ovlivňují účinnou léčbu. Jedním z negativních účinků je i vznik kardiotoxicity. Starší teorie byly založeny na vzniku reaktivních forem kyslíku (ROS), nicméně novější teorie potvrzují i ovlivnění složitých buněčných drah antracykliny, případně jejich metabolity. Předmětem této práce bylo studium enzymů, které metabolizují antracykliny, konkrétně daunorubicin. Karbonyl redukující enzymy jsou NAD(P)H-dependentní oxidoreduktasy, které jsou schopné katalyzovat redukci aldehydů a ketonů na primární a sekundární metabolity, tímto způsobem je přeměňován právě daunorubicin na daunorubicinol. Proto jsme se nejvíce zajímali o enzymy z nadrodiny aldo-ketoreduktas a dehydrogenas/reduktas s krátkým řetězcem (SDR), konkrétně enzymem AKR1C3 a CBR1. Řada...
|
|
| |
|
|
Gene expression profiling after experimental perinatal asphyxia and the effect of complement-derived anaphylatoxin C3a
Šourková, Hana ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Šimůnek, Tomáš (oponent)
Úvod: Komplement se účastní ochrany a reparace mozku po jeho poškození. Pro porozumění molekulárním mechanismům těchto procesů jsme provedli profilování genové exprese s využitím kvantitativní polymerázové řetězové reakce v reálném čase (qPCR), která je jednou z nejpřesnějších moderních strategií pro analýzu genové exprese. Projekt: Projekt byl zaměřen na profilování exprese vybraných genů potenciálně ovlivňujících ztrátu a ochranu neuronální tkáně, a to během tří týdnů po hypoxicko-ischemickém poškození mozku, modelujícím perinatální asphyxii. Nedávné experimenty ukázaly, že exprese C3a pod kontrolou GFAP promotoru (C3a/GFAP) zmenšila poškození hipokampu po ligaci levé karotidy u novorozených myší o 50% ve srovnání s kontrolními myšmi. Projekt rovněž posuzuje jak místní exprese C3a/GFAP transgenu ovlivňuje expresi vybraných genů. Exprese genů byla analyzována na vzorcích z ipsilaterální a kontralaterální části hipokampu a ipsilaterální části mozkové kůry, které byly získány v čase poranění, 6 a 24 hodin; 3, 7 a 21 dní po něm. Výsledky: Výsledky ukázaly, že se regulace genové exprese po hypoxicko-ischemické příhodě liší v čase a intenzitě a může být také odlišná v příslušných oblastech mozku. Zkoumané geny lze zařadit do rodin se vztahem k uvolnění a deaktivaci neurotransmiteru (SYN II, SYN III,...
|
|
|
Zkoumání účinku CTA1R7K-ChrA-DD způsobujícího toleranci na BDC2.5 CD4 buňky vyvolávající diabetes
Kadová, Zuzana ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Zuzana Kadová Školitel: Prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název diplomové práce: Zkoumání účinku CTA1R7K-ChrA-DD způsobujícího toleranci na BDC2.5 CD4 buňky vyvolávající diabetes Tento projekt byl zaměřen na studium CTA1R7K-ChrA-DD proteinu, navozujícího toleranci. Bylo zkoumáno, jestli tento protein může inhibovat autoimunitní diabetes a zda-li léčba CTA1R7K-ChrA-DD proteinem může ovlivňovat proliferaci a produkci cytokinů BDC2.5 CD4 buněk. Léčba CTA1R7K-ChrA-DD proteinem byla účinná, když myši byly léčeny vícekrát (ale pouze jednou ze dvou opakovaných pokusů s použitím stejného protokolu), na druhou stranu, když obdržely pouze jednu dávku, léčba byla bez efektu. Po in vitro restimulaci PS3 peptidem by se dalo očekávat, že u myší, které byly léčeny CTA1R7K- ChrA-DD proteinem bude produkce INF gamma a proliferace snížena, ale ve většině případů, jsme dostali opačný výsledek. Výsledky této studie naznačují, že CTA1R7K-ChrA-DD protein by mohl v budoucnu být jednou z možností léčby autoimunitního diabetu.
|
|
|
Vliv vybraných cytostatik určených pro terapii leukémie na aktivitu lidských enzymů redukujících karbonylovou skupinu
Šmídlová, Monika ; Novotná, Eva (vedoucí práce) ; Wsól, Vladimír (oponent)
Univerzita Karlova Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Bc. Monika Šmídlová Školitel: RNDr. Eva Novotná, Ph.D. Název diplomové práce: Vliv vybraných cytostatik určených pro terapii leukémie na aktivitu lidských enzymů redukujících karbonylovou skupinu Klíčová slova: reduktázy, leukémie, cytostatika, inhibice K léčbě akutních myeloidních leukémií (AML) i akutních lymfoidních leukémií (ALL) se stále hojně používají anthracyklinová antibiotika, především daunorubicin. I přes vysokou efektivitu těchto léčiv je léčba limitována kvůli kardiotoxicitě a rezistenci nádorových buněk vůči anthracyklinům. Mezi mechanismy, které se podílí na vzniku anthracyklinové rezistence patří metabolická přeměna (redukce) anthracyklinů na méně účinné sekundární alkoholy, která je katalyzovaná enzymy ze skupiny aldo-ketoreduktas (AKR) a dehydrogenas/reduktas s krátkým řetězcem (SDR). Objevení vhodných inhibitorů AKR a SDR enzymů by tak mohlo pomoci k překonání anthracyklinové rezistence i ke snížení kardiotoxicyty způsobené těmito léčivy. Cílem této diplomové práce bylo zjistit, zda kyselina all-trans-retinová, cyklofosfamid, cytarabin, kladribin a prednisolon inhibují anthracyklinreduktasy AKR1A1, AKR1B10, AKR1C3 a AKR7A2 a CBR1. Metodika diplomové práce zahrnovala in vitro inkubace...
|
|
|
Zavedení experimentálních technik pro přípravu rekombinantních enzymů na modelu CBR3
Reissová, Helena ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Novotná, Eva (oponent)
Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Mgr. Helena Reissová Školitel: prof. Ing. Vladimír Wsól, Ph.D. Název rigorózní práce: Zavedení experimentálních technik pro přípravu rekombinantních enzymů na modelu CBR3. Tato práce byla zaměřena na zavedení experimentálních technik pro přípravu rekombinantních proteinů. Jako modelový protein byla použita lidská karbonylreduktasa 3 (CBR3). Rekombinantní CBR3 je využívána v četných metabolických studiích a její struktura je již dobře popsána jak na úrovni sekvence aminokyselin tak i celého prostorového uspořádání. Bylo popsáno i několik jejích substrátů, ale stále ještě není dostatečně popsána a objasněna její fyziologická funkce a role v metabolismu endogenních látek a xenobiotik. Příprava rekombinantního proteinu vycházela z izolace plasmidu nesoucího jeho kódovou sekvenci (vektoru pOTB7), dále následovala polymerasová reakce (PCR) s vhodně navrženými primery obsahujícími restrikční místa pro vybrané endonukleasy. Produkt PCR byl ligován do amplifikačního vektoru (pCR® 2.1-TOPO® ), vektor byl namnožen v transformovaných kompetentních buňkách. Kódová sekvence byla z vektoru vyjmuta pomocí restrikčních endonukleas a následně subklonována do otevřeného expresního vektoru (pET-15b). Správnost...
|
|
|
Klonování a exprese lidské karbonylreduktasy CR-1
Laštovková, Linda ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Šimůnek, Tomáš (oponent)
Purifikace plasmidu pOTB7 s kódovou sekvencí karbonylreduktasy 1 (CBR1) v buňkách Escherichia coli (E. coli) byla provedena metodou alkalické lýze. Sekvence CBR1 byla namnožena metodou polymerasové řetězové reakce (PCR) za přítomnosti navržených primerů. Levý primer obsahoval restrikční místo pro restrikční endonukleasu NdeI a pravý primer pro restrikční endonukleasu XhoI. Správnost výsledků prvního kroku byla potvrzena ověřením velikosti nasyntetizovaného fragmentu a následně restrikční analýzou pomocí restrikční endonukleasy BamHI. Takto připravená kódová sekvence CBR1 byla ligována do vektoru Topo, který byl dále následně transformován do kompetentních buněk E. coli. Po namnožení E. coli byl vektor Topo obsahující kódovou sekvenci CBR1 purifikován metodou alkalické lýze. Úspěšnost druhého kroku byla ověřena porovnáním velikosti cyklického vektoru Topo bez vloženého insertu a vektoru Topo s kódovou sekvencí CBR1 na agarózovém gelu a následnou restrikční analýzou pomocí restrikční endonukleasy BamHI. Posledním krokem byla subklonace kódové sekvence CBR1 z vektoru Topo do expresního vektoru pET15b.
|
|
|
Projekt "Zdravé město"
Valčíková, Šárka ; Wsól, Vladimír (vedoucí práce) ; Kvasničková, Eva (oponent)
V letech 2005-2007 bylo v rámci projektu "Zdravé město" vyšetřeno celkem 1028 obyvatel města Kroměříž. S použitím údajů, které tak byly získány, byly vyhodnoceny některé epidemiologické charakteristiky občanů tohoto regionu a získány důležité poznatky přímo realizovatelné v preventivní klinické praxi. Jsou to tyto: 1. Projekt "Zdravé město" není pilotní studie. Kontaktní centra navštěvují především občané, kteří tím dávají průchod aktivnímu zájmu o své zdraví. V této populaci převažují ženy a starší občané. Řada z nich má porušené zdraví a incidence kardiovaskulárních faktorů značně převyšuje "normální" populaci. Ukázalo se, že 37% z vyšetřených má nadváhu a 13% je obézních. 16% občanů mělo hypertenzi převyšující 140/90 mm Hg. 57% trpělo poruchou metabolismu lipidů a u 14% byla zachycena hyperglykémie. 2. Následně byl sledován vztah BMI indexu k vyšetřovaným rizikovým markerům (systolickému a diastolickému tlaku, sérovým koncentracím celkového cholesterolu, LDL cholesterolu, HDL cholesterolu, triacylglycerolů a glukosy). Byly prokázány známé významné vztahy mezi stupněm nadváhy a hodnotami krevního tlaku a koncentrací triacylglycerolů na jedné straně a naopak statisticky bezvýznamné vztahy mezi koncentrací celkového cholesterolu a jeho frakcí ke stupni nadváhy na straně druhé. 3. Sledování vztahů...
|
host ::
RSS.