|
|
Příprava vazebné domény proteinu B7-H6 s vysokou afinitou
Jeníček, Jakub ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Čermáková, Michaela (oponent)
Přirozeně zabijácké buňky jsou součástí přirozené imunity a hrají důležitou roli při ochraně organismu. Zásadní jsou v obraně před nádorovými onemocněními a případně v protinádorové terapii. Proto jsou tyto buňky dlouhodobě předmětem mnoha výzkumů, neboť nádorová onemocnění představují celosvětově jednu z nejčastějších příčin úmrtí. Léčba těchto onemocnění bývá často složitá a invazivní, a proto je výhodné hledat nové terapeutické přístupy, které by využívaly již existující obranné mechanismy. Jedním z klíčových mechanismů, který NK buňky využívají pro rozpoznávání nádorových buněk a jejich eliminaci je receptor NKp30. Tento receptor může po vazbě aktivačního ligandu vyvolat cytotoxickou odpověď, která vede k likvidaci nádorové buňky. Jedním z aktivačních ligandů tohoto receptoru je protein B7-H6, jenž se přirozeně vyskytuje na povrchu buněk některých nádorů. Přesná podstata interakce B7-H6 a NKp30 však není dosud dokonale popsána. Tato práce se zabývá různými metodami přípravy fluorescenčně značené domény B7-H6, která by umožňovala vizualizaci receptoru NKp30 na povrchu buněk, čímž by přispěla k lepšímu popisu interakce těchto molekul. KLÍČOVÁ SLOVA NK buňky, NKp30, B7-H6, sortasa A, HEK293
|
|
|
Produkce rekombinantního IL-2 imunocytokinu nového typu
Bednaříková, Kristýna ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Interleukin 2 je glykoprotein, který se u člověka skládá ze 133 aminokyselin a je produkován pomocnými T buňkami pro zesílení imunitních reakcí. IL-2 má mnoho imunostimulačních a imunoregulačních funkcí a bylo prokázáno, že aktivuje cytotoxickou funkci přirozených zabíječských buněk, T lymfocytů a monocytů a podporuje cytotoxicitu těchto efektorových buněk. Pokud je v rámci terapie IL-2 podán ve vyšších dávkách, stimuluje efektorové lymfocyty a brání organismus před patogeny a nádorovými buňkami. Pokud je IL-2 podán v nižších dávkách, tak dochází k stimulaci T regulačních buněk, které inhibují imunitní reakci a tím dochází k udržení autotolerance. Zatímco dosavadní studie ukázaly, že IL-2 je účinný při léčbě malignit, byla také pozorována značná toxicita. V posledních letech byly publikovány studie na základě kterých bylo zjištěno, že pokud je IL-2 kovalentně vázán skrz oligopeptidovou spojku na anti-IL-2 monoklonální protilátky, dojde ke zvýšení jeho biologické aktivity in vivo. Zároveň může tato protilátka stericky bránit vazbě na některé podjednotky IL-2 receptoru a přispět tak k selektivní aktivaci a expanzi přirozeně zabíječských buněk a T efektorových buněk, zatímco T regulační stimulovány nejsou. Při spojení IL-2 s anti-IL-2 protilátkou hraje klíčovou roli délka peptidové spojky, jejíž prodloužení by...
|
|
|
Role N-glykosylace v homooligomerizaci receptoru přirozené cytotoxicity NKp30
Tulpa, Matouš ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Bělonožníková, Kateřina (oponent)
NK buňky hrají klíčovou roli v boji proti buňkám, které byly napadeny virem, prvokem nebo podlehly maligní transformaci. Kromě toho také regulují aktivitu a množství dalších buněk imunitního systému. Cílové buňky rozpoznávají pomocí svých aktivačních a inhibičních receptorů, ze kterých přijímají aktivační a inhibiční signály, na nichž je závislá cytotoxická odpověď NK buňky. Mezi signály panuje dynamická rovnováha, která rozhoduje o životě a smrti cílové buňky. Pokud převáží aktivační signály, bude cílová buňka eliminována. Pokud převáží inhibiční signály, pak cytotoxická odpověď nenastane. Receptor NKp30 patří do superrodiny receptorů podobných imunoglobulinům. Jedná se o důležitý aktivační receptor, který rozpoznává celou řadu ligandů, mezi které patří hemaglutinin viru vakcinie a ektromélie, protein pp65 lidského cytomegaloviru, B7-H6, BAG-6 a galektin-3. Extracelulární doména receptoru NKp30 je za určitých podmínek schopna v roztoku homooligomerizovat. První podmínkou je přítomnost N-glykosylace, druhou podmínkou je přítomnost 15 aminokyselin dlouhé "stalk" domény, která propojuje ligand vázající doménu s transmembránovým α-helixem. Cílem této práce bylo ověřit, které ze třech dostupných míst N-glykosylace receptoru NKp30 je zodpovědné za jeho homooligomerizaci. Dalším cílem byla biofyzikální...
|
|
|
Rekombinantní exprese potkaního NK buněčného receptoru Clr-b v přítomnosti fluorovaných analogů monosacharidů
Urbanová, Zuzana ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
NK buňky jsou buňkami nespecifické imunity, které kromě likvidace tělu vlastních poškozených buněk také produkují chemokiny a cytokiny, kterými zasahují i do imunity specifické, stojí tedy na pomezí obou těchto druhů imunity. NK buňky na svém povrchu exprimují aktivační a inhibiční receptory, jejichž rovnováha udržuje buňku v inaktivovaném stavu, narušení této rovnováhy spustí cytotoxické mechanismy buňky. Dvěma z potkaních inhibičních receptorů NK buněk jsou receptory NKR-P1B a NKR-P1D, jejichž ligandem je protein Clr-b, což je receptor z rodiny proteinů podobných lektinům typu C. Cílem práce bylo rekombinantně připravit tento protein v prostředí sedmi fluorovaných analogů monosacharidů jakožto potenciálních inhibitorů N-glykosylace proteinu. Protein byl úspěšně exprimován v buněčné linii HEK293T ve formě konstruktu obsahujícího kromě extracelulární části Clr-b také Fc fragment lidského IgG a histidinovou kotvu, a to několikrát, pokaždé v prostředí jednoho ze sedmi fluorovaných analogů monosacharidů. Vzhledem k tomu, že glykosylace proteinů má výrazný vliv na jejich funkčnost, se inhibice glykosylace se jeví jako vhodné terapeutické řešení mnoha nemocí včetně například roztroušené sklerózy či rakoviny. Cílem zde bylo posoudit vliv fluorovaných analogů monosacharidů na přirozenou N-glykosylaci...
|
|
| |
|
|
Produkce a charakterizace mutované formy galektinu-3
Dubanych, Yurii ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Ječmen, Tomáš (oponent)
Přirozeně zabijácké buňky (NK buňky, z angl. natural killer) jsou velké granulární lymfocyty vrozené imunity, které jsou charakterizovány schopností zabíjet rakovinné a virem poškozené buňky bez předchozí aktivace. Cytotoxické funkce NK buněk jsou regulovány jednak prostřednictvím povrchových receptorů rozpoznávajících molekuly MHC-I, jednak přítomností sady aktivačních a inhibičních receptorů, které jsou mezi sebou za normálních podmínek v rovnováze. Osud cílové buňky proto záleží nejen na expresi MHC-I, ale i na expresi ligandů aktivujících receptory NK buněk. Jedním z aktivačních receptorů NK buněk je NKp30. Pro NKp30 byly objeveny tři specifické buněčné ligandy: lidský athanogen 6 asociovaný s BCL-2 (BAG-6, také známý jako BAT3), nádorový antigen B7-H6 a nově objevený ligand galektin-3. Všechny tyto ligandy jsou často exprimovány rakovinnými buňkami, přičemž BAG-6 a Gal-3 působí na funkce NK buněk inhibičně, což může být mechanismem úniku nádoru před imunitním systémem. Proto je Gal-3 novým potenciálním cílem léků, které inhibicí Gal-3 mohou napomáhat imunitnímu systému bránit se proti maligně transformovaným buňkám. Tato bakalářská práce zahrnuje ověření vlivu mutace Cys173 - Ser173 v sacharid vazebné doméně galektinu-3 na vazbu receptoru NKp30 pomocí gelové permeační chromatografie. Dále se...
|
|
|
Příprava mutovaných forem proteinu B7-H6
Malá, Viktorie ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Bělonožníková, Kateřina (oponent)
Přirození zabijáci zvaní NK buňky (z angl. Natural Killers) jsou velmi podstatnou součástí imunitního systému. Jsou to tzv. přirození zabíječi, nesou na svém povrchu řadu receptorů. Pro imunitní dohled jsou zásadní dva typy receptorů dle funkce zvané inhibiční a aktivační. Inhibiční receptory zajišťují autotoleranci. Druhým typem jsou aktivační receptory, jejichž aktivace vede ke spuštění cytotoxické odpovědi, případně k zapojení dalších složek imunitního systému (např. makrofágů). Aktivační receptor NKp30 (označovaný také jako NCR3 nebo CD337) je protein z rodiny přirozeně cytotoxických receptorů (NCR, z angl. Natural Cytotoxicity Receptors). Je jedním z hlavních lidských NK-buněčných aktivačních receptorů s potenciálním využitím v cílené protinádorové terapii. Aktivačním ligandem receptoru NKp30 je protein B7-H6, který se běžně nevyskytuje na povrchu zdravých buněk. Vyskytuje se výhradně na buňkách, které jsou výrazně stresované, tedy např. na infikovaných nebo maligně transformovaných buňkách. Nese-li maligně transformovaná buňka na svém povrchu B7-H6, dojde ve většině případů k jejímu rozpoznání a eliminaci takřka ihned při jejím vzniku. Protože však ne všechny nádorové buňky jsou B7- H6 pozitivní, nabízí se možnost jejich zviditelnění pro imunitní systém právě skrz dekoraci proteinem B7-H6....
|
|
|
Rekombinantní exprese receptoru myších NK buněk NKR-P1C
Rudenko, Anastassiya ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Čermáková, Michaela (oponent)
NK buňky (z angl. Natural Killers) představují buňky stojící v první řadě obrany organismu proti různým nebezpečím, jakými jsou například viry nebo rakovinné buňky. NK buňky mají schopnost rozpoznat a zničit nežádoucí buňky několika různými způsoby, které se hodně liší od obranných mechanismů například u T- nebo B-lymfocytů. NK buňky nesou na svém povrchu širokou škálu různých aktivačních a inhibičních receptorů, pomocí kterých dokážou rozlišit zdravé buňky od škodlivých, či infikovaných buněk. NKR-P1 (z angl. natural killer receptor-protein 1) je první objevená rodina NK buněčných receptorů podobných lektinům C-typu, do které patří jak aktivační, tak inhibiční receptory. NKR-P1C je aktivační receptor, který je schopen tvorby homodimerů na povrchu NK buněk. Hlavními ligandy NKR-P1 rodiny receptorů jsou imunoenvasiny myšího cytomegaloviru a jiné molekuly strukturně odlišné od MHC glykoproteinů I. třídy. Tato práce se zabývá rekombinantní expresí receptorového proteinu NKR-P1C. Pomocí plazmidu pUT7 byla systémem PiggiyBac připravena stabilně transfekovaná linie buněk HEK293T nesoucí gen pro expresi extracelulární části NKR-P1C spojenou s Fc fragmentem IgG, které mezi sebou nesou zásahovou sekvenci pro štěpení TEV proteasou. Protein byl purifikován pomocí afinitní a gelové permeační chromatografie a...
|
|
|
Produkce IL2-fúzních protilátek a stanovení jejich biologické aktivity
Frantová, Eliška ; Vaněk, Ondřej (vedoucí práce) ; Kubíčková, Božena (oponent)
Interleukin 2 je malý cytokin s mnoha důležitými imunitními funkcemi. Uplatňuje se zejména jako růstový faktor T buněk, ale působí také na další imunitní buňky a to především na NK a NK-T buňky. IL-2 ve vyšších dávkách indukuje diferenciaci a proliferaci buněčné populace efektorových a paměťových T buněk, které se vyznačují cytotoxicitou a jsou schopny účinné obrany organismu před patogeny anebo nádorovými buňkami. Naproti tomu IL-2 v nízkých dávkách stimuluje populaci Treg, které tlumí imunitní reakce a pomáhají předcházet autoimunitním onemocněním. V nádorové terapii je však stimulace této buněčné populace nežádoucí. Protože je volný IL-2 ve vysokých dávkách pro organismus toxický, byly již dříve navrženy strategie, pomocí kterých by se biologický efekt IL-2 potencoval. Jako jedna z nejslibnějších se jeví jednořetězcový rekombinantní fúzní konstrukt, kde je IL-2 kovalentně vázán pomocí oligopeptidové spojky na anti-IL-2 monoklonální protilátku (mAb). Na základě poznatků ze studia IL-2/anti-IL-2 mAb imunokomplexů by v porovnání s volným IL-2 tento imunocytokin (IC) mohl poskytnout značné terapeutické benefity in vivo, a to především velmi robustní posílení biologické aktivity, selektivní stimulaci konkrétních buněčných populací dle zvolené protilátky a snížení systémové toxicity. Důležitou roli u...
|
|
| |
host ::
RSS.