|
|
Characterization of protein-protein interactions between Forkhead box O (FOXO) and p53 transcription factors
Mandal, Raju ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Hrabal, Richard (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Transkripční faktor p53 hraje klíčovou roli v regulaci buněčného cyklu, opravě DNA, apoptóze, obraně před nádorovými onemocněními a udržování buněčné homeostázy. Při buněčném stresu p53 přímo interaguje s transkripčním faktorem Forkhead box O (FOXO) 4, čímž zvyšuje expresi proteinu p21, což vede k indukci buněčné senescence. Molekulární mechanismus interakce těchto dvou klíčových transkripčních faktorů však zůstává nejasný kvůli absenci strukturních dat. Hlavním cílem této dizertační práce byla strukturní charakterizace interakce mezi FOXO4 a p53 prostřednictvím několika biofyzikálních technik včetně metody sedimentační rychlosti analytické ultracentrifugace (SV AUC), nukleární magnetické rezonance (NMR), chemického zesítění spojeného s hmotnostní spektrometrií. Dále byla studována DNA vazebná afinita obou proteinů k jejich příslušným konsenzuálním DNA sekvencím v přítomnosti nebo nepřítomnosti jejich vazebných partnerů a byl porovnán p53-vazebný povrch Forkhead domény tří různých FOXO proteinů. Připravené proteiny byly také použity pro optimalizaci nízkomolekulárních sloučenin umožňujících inhibici interakce mezi FOXO3 a DNA. Získané výsledky ukázaly, že p53 interaguje s FOXO4 prostřednictvím komplexních přechodných interakcí zahrnujících strukturované i neuspořádané oblasti obou proteinů. NMR...
|
|
|
Vliv proteinu 14-3-3 na intradoménové interakce ubiktivin ligasy Nedd4-2
Pohl, Pavel ; Obšilová, Veronika (vedoucí práce) ; Žáková, Lenka (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
CZ Lidská ubikvitin ligasa Nedd4-2 (NEDD4L) ubikvitinuje široké spektrum membránových proteinů a receptorů a hraje tak klíčovou roli v udržování homeostázy organismu. Tento enzym je regulován fosforylací a následnou interakcí s proteiny 14-3-3, čímž je primárně ovlivněna schopnost proteinu Nedd4-2 interagovat s různými substráty. Jen velmi málo je však známo o molekulární podstatě této protein-proteinové interakce. V této práci jsme se zaměřili na biofyzikální charakterizaci úlohy jednotlivých fosforylačních míst a mapování strukturních změn Nedd4-2 způsobených vazbou proteinů 14-3-3. Naše experimenty za užití metod analytické ultracentrifugace odhalily, že k stabilní vazbě proteinu Nedd4-2 na proteiny 14-3-3 je zapotřebí primárně dvou fosforylačních míst Ser342 a Ser448 . Krystalová struktura komplexu 14-3-3ηΔC:Nedd4-2335-455 T367A poté odhalila simultánní vazbu obou fosforylovaných reziduí do vazebného žlábku proteinu 14-3-3. Modelování na základě dat z maloúhlového rozptylu rentgenového záření a chemického zesítění spojeného s hmotnostní spektrometrií nastínilo rozsáhlé strukturní změny v oblasti jednotlivých domén proteinu Nedd4-2. Vazba proteinu 14-3-3η blokuje doménu WW3 proteinu Nedd4-2 v centrálním kanálu proteinu 14-3-3 a zároveň mění vzájemné pozice domén WW2 a WW4. WW domény Nedd4-2 jsou...
|
|
|
Charakterizace vazebného rozhraní komplexu transkripčních faktorů FOXO4 a p53
Brzezina, Adam ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Tato práce se zabývá studiem lidských transkripčních faktorů FOXO4 a p53. FOXO4 je členem podrodiny "O" FOX transkripčních faktorů. Geny kódující FOXO proteiny jsou evolučně konzervované mezi druhy. FOXO transkripční faktory regulují expresi genů, které se podílí na řízení metabolismu, buněčného cyklu a buněčné proliferace, přežití buněk a odolnosti vůči stresu. Pro svou schopnost zastavit buněčný cyklus a vyvolat apoptózu jsou považovány za tumorové supresory. Jejich funkce v rámci tumorigeneze se však ukazuje být složitější, protože nedávné studie poukazují na horší prognózu vývoje nádorů, u kterých je vyšší hladina exprese FOXO4. Protein p53 je důkladně studovaným přirozeně se vyskytujícím tumorovým supresorem. Buněčná odpověď po jeho aktivaci je do jisté míry podobná jako v případě FOXO4, rovněž umí blokovat progresi buněčného cyklu nebo vyvolat apoptózu v závislosti na buněčném typu a závažnosti/typu buněčného stresu. FOXO4 i p53 se ukazují být klíčové molekuly ovlivňující stárnutí. Za stresových podmínek spolu p53 a FOXO4 interagují, a společně tak zvyšují expresi proteinu p21, čímž indukují přechod buněk do senescentního stavu. Akumulace senescentních buněk je považována za jednu z hlavních příčin stárnutí a rozvoje s věkem spojených patologií. Tato bakalářská práce vznikla jako součást...
|
|
|
Pokročilé metody stanovení lektin-sacharidové interakce
Červený, Jakub ; Bosáková, Zuzana (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Spolehlivá a reprodukovatelná kvantifikace a podrobná charakterizace interakcí mezi biomedicínsky významným proteinem a jeho syntetickým sacharidovým ligandem může poskytnout nové informace pro návrh lepších diagnostických a terapeutických nástrojů. Vysoká citlivost a specifičnost jsou základními požadavky na proveditelnost analytické metody. Těchto parametrů může být obtížné dosáhnout u vysoce komplexních systémů, jako jsou komplexy lektin- sacharid. Na druhou stranu diagnostika a terapie na bázi sacharidů nabízí velkou výhodu detekce biologicky aktivních lektinových receptorů, které nelze dosáhnout pomocí protilátek. V této práci demonstrujeme použití techniky interferometrie na biovrstvě (BLI) ke sledování interakcí lektin-sacharid pro multivalentní systém. Pomocí funkcionalizace nového konstruktu galektinu-1 biotinylovanou značkou AVI in vivo bylo dosaženo vhodné imobilizace na biosenzoru bez ztráty lektinové aktivity. Díky vysoké citlivosti této techniky byly získány kinetické parametry interakce s připravenými multivalentními neoglykoproteiny založenými na epitopech LacNAc v rozsahu mikro- až nanomolárních KD. Komplementarita této metody byla paralelně prokázána měřením ITC a kompetitivní ELISA. Bylo zjištěno, že neoglykoprotein s nižším obsahem LacNAc má nižší KD (BLI - 230 nM; ITC - 81 nM)...
|
|
|
Eukaryotické exprese kyselých proteas.
Vodolánová, Lucie ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Nepenthesin I a neprosin jsou kyselé proteasy, které se přirozeně vyskytují v trávicích šťávách masožravých rostlin rodu Nepenthes. Oba enzymy jsou syntetizovány jako zymogeny, které jsou aktivovány v kyselém prostředí. Díky svým vlastnostem a štěpným preferencím jsou vhodné pro studium proteinů pomocí hmotnostní spektrometrie či jako doplněk bezlepkové diety při celiakii. Protože v trávicích šťávách rostlin Nepenthes se vyskytují v nízké koncentraci a prokaryotický expresní systém nevykazoval uspokojivé výsledky, je snaha o nalezení vhodnějšího expresního systému pro produkci jejich rekombinantních forem, který by produkoval enzymy se stejnými vlastnostmi jako ty přírodní a zároveň poskytoval vysoké výtěžky. Cílem této práce je příprava expresních vektorů s geny nepenthesinu I a neprosinu pro transfekci do eukaryotických expresních systémů buněk S2 a HEK 293. Klíčová slova: kyselé proteasy, nepenthesin I, neprosin, expresní vektory
|
|
|
Modulace DNA vazebné afinity transkripčních faktorů FOXO a p53 prostřednictvím protein-proteinových interakcí
Hofmanová, Adéla ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
4 Abstrakt Podtřída "O" transkripčních faktorů forkhead box (FOXO) představuje skupinu proteinů, které hrají zásadní roli v celé řadě buněčných procesů souvisejících se stresem, glukoneogenezí, kontrolou buněčného cyklu, apoptózou, senescencí a opravami poškozené DNA. Obecně jsou považovány za supresory nádorů. Ukázalo se však, že mohou naopak podporovat tumorigenezi a vyvolávat rezistenci na použitá chemoterapeutika. Navzdory mnoholetému výzkumu biologické role FOXO proteinů zůstává stále celá řada otázek, které je třeba zodpovědět. Je například otázkou, zda se nepatrné strukturní rozdíly pozorované v jinak vysoce homologních DNA-vazebných doménách jednotlivých zástupců FOXO promítají do jejich schopnosti vázat DNA. Není zcela jasné ani to, jak vazbu na DNA ovlivňují protein-proteinové interakce s vazebnými partnery. Nedávno byla popsána interakce FOXO transkripčních faktorů s proteinem p53, který bývá nazýván strážcem genomu kvůli zprostředkovávání reakce na akutní poškození DNA. Zdá se, že by vzájemná interakce proteinů FOXO a p53 mohla mít zásadní vliv na DNA vazebnou afinitu obou těchto proteinů. Na základě toho byly v rámci této práce exprimovány a purifikovány DNA-vazebné domény lidských transkripčních faktorů FOXO1, FOXO3 a FOXO4 (FOXO1(144-270), FOXO3(142-267) a FOXO4(86-211)) a transaktivační...
|
|
| |
|
|
Realizace zastřešení stáje pro skot ve Studenci
Pavlíček, Jiří ; Bříza, Lukáš (oponent) ; Mohapl, Martin (vedoucí práce)
Tématem bakalářské práce je zpracování stavebně technologického projektu pro zastřešení stáje pro skot ve Studenci. Práce obsahuje technickou zprávu se zaměřením na montáž střešní konstrukce, situaci stavby se širšími vztahy dopravních tras, technologicky předpis pro etapu zastřešení objektu, položkovy rozpočet s vykazem vyměr, návrh zařízení staveniště s technickou zprávou zařízení staveniště, časovy harmonogram, návrh strojní sestavy. Dále je v práci řešen kontrolní a zkušební plán, bezpečnost práce. Poslední bod práce pojednává o realizaci zastřešení objektů s větším rozponem.
|
|
| |
|
|
Deriváty protilátek využitelné k detekci lidské glutamátkarboxypeptidasy II
Bělousová, Nikola ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Rakovina prostaty je jedním z nejzávažnějších rakovinných onemocnění na světě, a proto je velmi důležitý vývoj vhodných diagnostických a terapeutických postupů. Glutamátkarboxypeptidasa II (GCPII) je v současné době posuzována jako jeden z nejzajímavějších markerů rakoviny prostaty díky své tkáňově specifické expresi. Zatímco ve zdravé tkáni prostaty se vyskytuje mizivé množství tohoto proteinu, spolu se vznikem nádoru se výrazně zvyšuje produkce GCPII v transformovaných buňkách. Množství GCPII v rakovinné tkáni dále stoupá spolu se vzrůstající invazivitou nádoru, proto je GCPII vhodný marker pro časná i pokročilá metastazující stadia rakoviny prostaty. Současný výzkum se zaobírá vývojem látek dostatečně citlivých a specifických pro detekci malého množství GCPII, například v počátečních stadiích rakoviny. Deriváty protilátek se ukazují jako molekuly vhodné pro tento účel, neboť vykazují vysokou afinitu a specificitu a minimální nežádoucí vedlejší účinky. Proteinové inženýrství umožňuje přípravu celé řady protilátkových molekul lišících se svou velikostí, vazebnými vlastnostmi, stabilitou a rozpustností a způsobem produkce. Odlišné deriváty jsou vyvíjeny pro účely diagnostické a terapeutické a pro zobrazovací techniky, pro které jsou vhodné molekuly o střední až malé velikosti. Jedním typem těchto...
|
host ::
RSS.