|
|
Myosin I and actin binding proteins in cell
Krásna, Hana ; Hozák, Pavel (vedoucí práce) ; Motlík, Jan (oponent) ; Pěknicová, Jana (oponent)
Existuje množství prací, které dokazují přítomnost a důležitost aktinu v jádře. Aktin se v buněčném jádře pojí s procesy od chromatinového remodelingu přes transkripci, splicing, až po jaderný transport. Pro zabezpečení dynamiky jaderných procesů se aktin spojuje s jedním ze základních motor proteinů, kterým je myozin. Poukazuji na úlohu aktinu a jaderného myozinu I (NMI) v transkripci ribozomálních genů pomocí RNA polymerázy I (Pol I). Mikroinjekcí protilátek proti aktinu a NMI jsme potlačili transkripci Pol I in vivo. Skupina in vitro pokusů potvrzuje inhibici transkripce Pol I po použití protilátek proti aktinu a NMI na čisté DNA i upraveném chromatinovém templátu. Koimunoprecipitační pokusy odhalují fyzické spojení aktinu a NMI s rRNA geny a s transkripčním komplexem Pol I. Zatím co se aktin váže na iniciační a elongační Pol I molekulu, NMI interaguje se subpopulací Pol I zodpovědnou za iniciaci vázanou na TIF-IA, tedy bazální transkripční faktor zodpovědný za regulaci rRNA syntézy. V současnosti je známých několik hypotéz o formě jaderného aktinu. Nedávné výzkumy poukazují na pravděpodobnou dynamickou rovnováhu mezi monomerní a polymerní formou. V této práci prezentuji ultrastrukturální rozložení šesti aktin vazebných proteinů (-aktinin, filamin, spektrin, paxilin, p190RhoGAP a tropomyozin)...
|
|
|
Vliv změněné funkce autofagosomů na patofyziologii Huntingtonovy choroby .
Kotrčová, Eva ; Motlík, Jan (vedoucí práce) ; Sládková, Jana (oponent)
Huntingtonova choroba, neurodegenerativní autozomálně dominantně děděné onemocnění, působí na buňku hned několika toxickými mechanismy. Jedním z nich je hromadění proteinových agregátů v cytoplazmě buňky, což může být problém zejména pro dlouhožijící buňky, jako jsou neurony. Autofagie (konkrétně makroautofagie) je důležitou katabolickou drahou, která má zásadní význam pro přežití buňky. Pokud by byla autofagie plně funkční, měla by proteinové agregáty eliminovat a tím snižovat toxický dopad nemoci na buňku. Ze studií této problematiky ovšem vyplývá, že se v autofagické dráze objevují defekty, zřejmě při pohlcování cytoplazmatického obsahu autofagosomem. V této práci jsem využila transgenní prasečí model Huntingtonovy choroby pro ověření hypotézy chybného fungování autofagické dráhy u jedinců trpících touto chorobou. Na mesenchymálních kmenových buňkách jsem prostřednictvím sledování markerových proteinů LC3 a p62 testovala reakci autofagie na různé způsoby umělé stimulace, přičemž se ošetření buněk chloridem amonným prokázalo jako nejefektivnější. Dále jsem na několika různě starých skupinách prasat sledovala vliv věku na funkci autofagie, zde se však neprojevily žádné signifikantní změny a to ani s ohledem na genotyp testovaných zvířat. Měla jsem možnost sledovat hladiny proteinů i na tkáních několika...
|
|
|
Příprava prasečích indukovaných pluripotentních kmenových buněk - model Huntingtonovy choroby.
Svobodová, Eliška ; Motlík, Jan (vedoucí práce) ; Fulka, Josef (oponent)
Dosud se nepodařilo vytvořit stabilní linie prasečích ESCs. Linie prasečích ES like buněk nejsou schopné dlouhodobé sebeobnovy nebo mají omezenou schopnost diferenciace. Alternativou k pESCs jsou piPSCs, které lze vytvořit přeprogramováním somatických buněk několika transkripčními faktory nesenými virovými vektory. Linie piPSCs se podařilo vytvořit několika skupinám. Většina linií piPSCs je ale závislá na transgenní expresi z důvodu nedokončeného procesu přeprogramování a nedostatečné aktivace vlastních genů pluripotence. Zvýšená exprese vnesených transgenů má negativní vliv na schopnost diferenciace piPSCs. Proto byly pro vytvoření piPSCs v této práci použity nevirové Piggybac transpozony, které lze z genomu zpětně vystřihnout. Zároveň byly pro přeprogramování použity malé molekuly (nízkomolekulární inhibitory), které jsou schopné zvýšit účinnost přeprogramování a aktivaci endogenních genů pluripotence. Tento systém pro vytvoření piPSCs má potenciál k vytvoření piPSCs v naivním stavu pluripotence. Po vystřižení transgenů je možné získat piPSCs bez inserčních mutací a s neomezenou schopností diferenciace. Prase (Sus Scrofa) je zároveň důležitým zvířecím modelem pro preklinické stadium výzkumu nemocí. Pro vytvoření piPSCs byly použity primární buňky z prasat s mutovaným huntingtinem. Integrace sekvence...
|
|
|
Změny exprese beta-cateninu v průběhu ontogeneze u miniprasat transgenních pro lidský mutovaný huntingtin
Žižková, Martina ; Motlík, Jan (vedoucí práce) ; Jarkovská, Karla (oponent)
Huntingtonova choroba je autozomálně dominantně dědičné neurodegenerativní onemocnění způsobené mutací v genu pro protein huntingtin. Jedním z komplexů, se kterými huntingtin interaguje, je ubiquitin-proteazomový systém, který je zodpovědný také za degradaci proteinu β-catenin. β-catenin je důležitá signální molekula a její vyvážená degradace je nezbytná pro správné fungování Wnt signální dráhy. V přítomnosti mutovaného huntingtinu je degradace β-cateninu narušena, ten se akumuluje v buňce a působí toxicky. Cílem mé diplomové práce bylo zjistit, zda u liběchovských miniprasat, zvířecího modelu Huntingtonovy choroby, jejichž genom obsahuje N-koncovou část lidského mutovaného huntingtinu, dochází k hromadění β-cateninu vlivem přítomnosti mutovaného huntingtinu. S využitím imunoblotu a specifických protilátek jsme zjistili, že u transgenních zvířat dochází k nárůstu hladiny mutovaného huntingtinu s věkem. Na rozdíl od endogenní formy nedochází k poklesu mutovaného huntingtinu ve striatu, což je kupodivu doprovázeno poklesem fosforylovaného β-cateninu. Naše výsledky však prokázaly hromadění β-cateninu v průběhu ontogeneze, a to v mezenchymových kmenových buňkách izolovaných z nejstarších transgenních zvířat. Zajímavé změny jsme navíc odhalili u některých transgenních miniprasat, kde dochází k výraznému poklesu...
|
|
|
Huntington's disease modeling and stem cell therapy in spinal cord disorders and injury
Hruška-Plocháň, Marián ; Motlík, Jan (vedoucí práce) ; Bjarkam, Carsten (oponent) ; Roth, Jan (oponent)
Neurologické poruchy postihují více než 14 % světové populace a společně s traumatickým poškozením mozku a míchy představují významnou zdravotní a socioekonomickou zátěž. Výskyt dědičných a idiopatických neurodegenerativních poruch a akutních poškození CNS navíc zaznamenává globální nárůst a neurovědecká komunita je proto stavěna před množství nezodpovězených otázek. To je důvodem, proč lze pokládat výzkum poruch CNS za klíčový. Vzhledem k tomu, že zvířecí modely nemocí a traumatických poškození CNS mají nepostradatelnou úlohu v projekci výsledků základního výzkumu do klinické praxe, tato práce je zaměřena na vytvoření nových zvířecích modelů a jejich využití v preklinickém výzkumu. Vytvořili a charakterizovali jsme transgenní model miniaturního prasete pro Huntingtonovu chorobu, jenž je doposud jediným prasečím modelem a představuje velice hodnotný subjekt pro dlouhodobé testování bezpečnosti léčby. Dále jsme zkřížili již charakterizovaný myší model Huntingtonovy choroby s myším modelem gad postrádajícím expresi UCHL1 s výsledky, které potvrzují teorii o "ochranné" funkci agregátů mutovaného huntingtinu a vedou k předpokladu, že funkce UCHL1 v ubiquitin proteazomového systému mohou být v Huntingtonově chorobě narušené. Traumatické poškození a amyotrofická laterální skleróza (ALS) jsou dvěma...
|
|
|
Analysis of pluripotent gene expression program in early embryos and embryonic stem cells
Moravec, Martin ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Motlík, Jan (oponent)
Pluripotence je schopnost buňky diferencovat do jakéhokoliv buněčného typu. Formuje se během časného embryonálního vývoje u savců a její vznik je spojen s reprogramací genové exprese na globální úrovni. Proces přirozeného vzniku pluripotence není stále zcela pochopen. Pro získání nového pohledu na události, které vedou ke vzniku pluripotence u savců, studovali jsme změny v genové expresi během oocyt-zygotického přechodu u myši. V tomto modelovém systému, oplodněné vajíčko podstoupí reprogramaci, která vede k vytvoření pluripotentních blastomer. Tyto blastomery zakládají samotné embryo. Cílem mé diplomové práce bylo analyzovat aktivaci transkripce během časného vývoje a vyvinout metodu pro monitorování exprese genů v oocytech, časných embryích a embryonálních kmenových buňkách. Metoda využívá kvantitativní PCR a umožnuje změřit expresi až 48 vybraných genů, které slouží jako markery pro maternální degradaci, aktivaci pluripotentního programu a diferenciaci do zárodečných linií. Dále ukazujeme, že náš systém monitoruje dynamiku transkriptomu během oocyt-zygotického přechodu, a získané výsledky jsou srovnatelné s daty naměřenými pomocí jiných metod. Díky našemu bioinformatickému přístupu jsme navíc identifikovali nové oocyt-specifické a zygotické nekódující RNA. Klíčová slova: pluripotence,...
|
|
|
Messenger RNA stability and microRNA activity in mouse oocytes
Flemr, Matyáš ; Svoboda, Petr (vedoucí práce) ; Motlík, Jan (oponent) ; Hampl, Aleš (oponent)
SOUHRN Přerod oocytu v zygotu představuje jediný fyziologický děj během životního cyklu savců, při kterém se z diferenciované buňky stává buňka pluripotentní. Toto buněčné přeprogramování je z velké většiny závislé na bezchybné post-transkripční regulaci maternálních mRNA. Porozumění mechanismům post-transkripční regulace v oocytech proto povede k významnému rozšíření našeho poznání v otázce buněčného přeprogramování. Mezi důležité post-transkripční regulátory v širokém spektru buněčných a vývojových procesů patří nedávno objevené krátké nekódující mikroRNA. Jejich funkce spočívá v represi cílených mRNA za pomoci proteinových komplexů, které spouštějí deadenylaci a odstranění ochranné čepičky z 5'-konce. Zmíněné komplexy se za normálních okolností sdružují v tzv. procesních tělískách (P-tělíska) v cytoplasmě. Tato práce přináší nečekané zjištění, že mikroRNA dráha je umlčená v plně dorostlých myších oocytech i během přerodu oocytu do zygoty. Toto zjištění je v souladu s pozorovaným rozpadem P-tělísek závislých na funkci mikroRNA během růstu oocytu a jejich absenci v plně dorostlých oocytech. Některé proteiny běžně obsažené v P-tělískách lokalizují v plně dorostlých oocytech do kortikální oblasti. Spolu s dalšími RNA-vazebnými faktory vytvářejí tyto proteiny ve finální fázi oocytárního růstu sub- kortikální...
|
|
|
Biomedicínské modely Huntingtonovy choroby
Žižková, Martina ; Motlík, Jan (vedoucí práce) ; Moravec, Jan (oponent)
Huntingtonova choroba je dědičné neurodegenerativní onemocnění způsobené expanzí CAG sekvencí do genu pro protein huntingtin. Takto mutovaný protein způsobuje degeneraci neuronů v mozku postižených pacientů, což vede k motorickým poruchám a rozkladu osobnosti. Kvůli nástupu projevů v dospělosti je tato nemoc velice zákeřná. Doposud neexistuje vhodná léčba, ale mnoho výzkumných týmů se soustředí na navržení vhodných léčebných postupů. K tomu je nezbytné vytvořit zvířecí modely Huntingtonovy choroby, na kterých budou možné terapeutické přístupy testovány. V této práci se snažím přehledně shrnout a popsat jednotlivé zvířecí modely, které se ve výzkumu používají. Nejčastěji používanými modelovými zvířaty jsou, díky snadnému chovu a nízké ceně, hlodavci. Mnohem důležitější jsou však zvířata příbuznější člověku, jako jsou ovce, prasata a primáti. Důležitým kritériem modelových organismů je způsob, jakým byly připraveny. Lze je v podstatě rozdělit na genetické a negenetické, přičemž platí, že genetické modely lépe napodobují komplexní projev nemoci u lidí. Tvorba zvířecích modelů Huntingtonovy choroby vede nejen k lepšímu porozumění podstatě nemoci, ale i k vyvinutí vhodné terapie pro pacienty s touto chorobou.
|
|
|
Buněčná terapie na zvířecích modelech- preklinické studie
Juhásová, Jana ; Motlík, Jan (vedoucí práce) ; Grim, Miloš (oponent) ; Jendelová, Pavla (oponent)
Pokrok v buněčné terapii se může rozvíjet jedině s použitím vhodných experimentálních modelů. Pro klinické využití nových léčebných postupů získaných ze studií na laboratorních zvířatech je nutné ověření na velkém zvířeti. Jedním z vhodných a lékařskou obcí uznaných preklinických zvířecích modelů je bezpochyby miniaturní prase, které je fyziologicky a rozměrově blízké člověku. Tato dizertační práce proto představuje přehled našich experimentálních studií týkajících se možného využití mezenchymových a nervových kmenových buněk pro léčbu onemocnění postihujících pohybový aparát a nervovou tkáň u lidí nebo zvířat. V první části dizertační práce je stručnou formou popsaná současná problematika buněčné terapie a zvířecích modelů, mezenchymových buněk případně jejich kombinace s novými typy nosičů, neurogeneze, nervové kmenové buňky a jejich potenciální použití v terapii poškozené míchy. Druhá část práce je zaměřena na přehled vytyčených cílů a metodik jakými jsme je chtěli dosáhnout. Třetí část byla věnována jednotlivým publikacím. Naše experimenty uskutečněné na králících s iatrogenním poškozením růstových plotének, které měly napodobit podmínky vzniku valgózních deformit u rostoucích kostí v klinické praxi, poukázaly na pozitivní preventivní a terapeutické účinky nových typů nosičů osazených...
|
|
| |
host ::
RSS.