|
|
Molecular mechanisms of Wip1 phosphatase function in DNA damage response
Štorchová, Radka ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Fajkus, Jiří (oponent) ; Líčeníková Hořejší, Zuzana (oponent)
Lidské buňky jsou neustále vystaveny různým faktorům, které způsobují poškození DNA a aktivují odpověď na poškození DNA (DDR). V závislosti na závažnosti poškození DNA může DDR napomáhat dočasnému zastavení cyklu buněk (kontrolní bod buněčného cyklu, "checkpoint"), trvalému zastavení růstu (senescence) nebo programované buněčné smrti (apoptóze). Signál DDR je regulován kaskádou post-translačních modifikací, kde klíčovými mediátory jsou fosfoproteinové kinázy ATM, ATR a DNA-PK. Fosfatáza Wip1 (kódovaná genem PPM1D) hraje důležitou roli v ukončení DDR fosforylací mnoha cílů těchto kináz. V této práci jsme zkoumali funkce PPM1D nezávislé na kontrolních bodech buněčného cyklu v buňkách a popsali jsme několik nových substrátů. Zjistili jsme, že PPM1D interaguje se shelterinovým komplexem a nachází se na telomerách. PPM1D desfosforyluje shelterinový protein TRF2 na S410. Fosforylace TRF2 na S410 zvyšovala jeho interakci s TIN2, což nepřímo zvyšovalo množství TPP1 na telomerách. Buňky s overexpresí PPM1D měly zvýšený počet telomerických fúzí. Tato zjištění mohou být velmi důležitá pro některé typy rakoviny, zvláště ty, které vykazují vysoké hladiny PPM1D nebo obsahují mutace v C-konci PPM1D. Pro ověření publikovaných, a detekci možných nových, substrátů PPM1D jsme vyvinuli novou metodu, využívající...
|
|
|
Role of the WIP1 phosphatase in the nucleolus
Palková, Natálie ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Sztacho, Martin (oponent)
Protein fosfatáza 2C delta (známá jako WIP1) je důležitým negativním regulátorem signalizace odpovědi buňky na poškození DNA (DDR). Jako protein vázaný na chromatin defosforyluje, a tedy inaktivuje ATM kinázu a transkripční faktor p53. Zvýšená exprese WIP1 potlačuje funkci tumour supresoru p53 a přispívá k rozvoji řady nádorových onemocnění včetně nádorů prsu a mozku. V posledních letech bylo ukázáno, že WIP1 může regulovat rovněž buněčné procesy, které nejsou přímo spojeny s DDR, jako je například zajištění stability telomer. Alternativní funkce proteinu WIP1 však nebyly dosud plně pochopeny. V této práci jsme popsali novou roli proteinu WIP1 v jadérku, organele zodpovědné za produkci ribozomů. Zjistili jsme, že WIP1 asociuje s mnoha jadérkovými proteiny, a pomocí delečních mutant jsme identifikovali jadérkovou lokalizační sekvenci (NoLS) na C-konci proteinu. Pomocí super-rezoluční mikroskopie jsme identifikovali lokalizaci WIP1 fosfatázy ve fibrilárních centrech jadérka . Za použití inducibilního Cas9 systému pro generování dvouřetězcových zlomů v rDNA jsme dále zjistili, že WIP1 ovlivňuje akumulaci faktorů zajišťujících opravu poškození DNA. Analýza založená na kvantitativní mikroskopii ukázala, že aktivita WIP1 má vliv také morfologii jadérka. Na základě našich výsledků usuzujeme, že WIP1...
|
|
|
The role of truncated PPM1D/Wip1 phosphatase in cancer
Martiníková, Andra-Stefania ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Souček, Pavel (oponent) ; Mistrík, Martin (oponent)
Poškození DNA v buňkách spouští aktivaci buněčne signální dráhy odpovědi na poškození DNA (DDR) do opravení DNA se tak zastaví buněčný cyklus. Opětovné zahájení buněčného cyklu je zahájeno pomocí PPM1D/WIP1 fosfatázy, která po opravení poškození defosforyluje markery poškození DNA. DDR tak brání nestabilitě genomu nebo vývoji rakoviny. Mutace genu Ppm1d pak působí vysoce stabilní zkrácený protein, který je pozorován jak u onkologických pacientů, tak i v rakovinných buněčných liniích. V této dizertační práci jsme využili model transgenní myši, ve které vedly mutace exonu 6 genu Ppm1d k expresi zkrácené varianty PPM1D proteinu. U myší se zkraceným PPM1D v brzlíku/thymu (Ppm1dT/+ ) byly pozorovány jak vysoké hladiny PPM1D proteinu, tak i snížená aktivace dráhy DDR po vystavení IR. Následně byly Ppm1dT/+ myši kříženy s Trp53+/- heterozygotními knock-out myšmi, které jsou náchylné k thymickému lymfomu. Získaní Ppm1dT/+ Trp53+/- dvojití mutanti měli po IR zvýšenou frekvenci T-buněčných lymfomů ve srovnání s mutanty pouze v Trp53+/- . Následně bylo pozorováno, že zkrácená varianta PPM1D vede k defektům aktivace kontrolních bodů buněčného cyklu v lidských netransformovaných RPE buňkách, které pokračují v proliferaci navzdory přítomnému poškození DNA. Po vystavení buněk RPE1 replikačnímu stresu byla...
|
|
|
Opravy DNA v oocytech a preimplantačních embryích
Koubovská, Markéta ; Ďuríček, Tomáš (vedoucí práce) ; Macůrek, Libor (oponent)
V diplomové práci jsme se zaměřili na vliv hormonální stimulace na integritu DNA savčích oocytů. Později jsme se také věnovali jejímu vlivu na integritu DNA savčích embryí a jejich vývojový potenciál. Udržení integrity DNA v pohlavních buňkách je klíčové pro jejich kvalitu při oplození a další vývoj po oplození. Integrita DNA je ohrožována různými druhy poškození, zejména pak vznikem DNA dvouřetězcových zlomů. V práci jsme zkoumali DNA poškození myších oocytů a raných embryí v závislosti na dávce hormonální stimulace pomocí hormonu PMSG. Imunofluorescenční detekce γ-H2AX, markeru pro DNA dvouřetězcové zlomy, v nezralých GV oocytech nám potvrdila primární hypotézu, že se se zvyšující dávkou hormonální stimulace zvyšoval počet DNA dvouřetězcových zlomů. To samé jsme provedli také u starých myší, kde mezi skupinami nebyl signifikantní rozdíl jako tomu bylo mezi jednotlivými skupinami mladých myší. Pomocí mikroskopie živých buněk jsme zaznamenali mírné časové zpoždění v meiotické maturaci u oocytů z hyperstimulovaných myší oproti kontrole. Ve zralých MII oocytech byl také pozorován trojnásobný nárůst intenzity γ-H2AX fluorescence. Tento rozdíl mizí v oplozených zygotách, kde byly jak v kontrolní, tak hyperstimulované skupině přítomné γ-H2AX foci jen v samčím prvojádře. Z hlediska vývojového potenciálu...
|
|
|
New molecular mechanisms involved in cell cycle control
Aquino, Cecilia ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Anger, Martin (oponent) ; Braun, Marcus (oponent)
Cecilia Aquino Perez, M. Sc. Abstrakt doktorské disertační práce V této doktorské práci jsme se zaměřili na nalezení a pochopení nových mechanismů řídících buněčný cyklus v normálních podmínkách i v kontextu buněčné odpovědi na různé formy stresu. Nejdříve jsme se zaměřili na studium Polo-like kinázy 3, která byla již dříve popsána v aktivaci kontrolních bodů cyklu v důsledku poškození DNA. Pomocí technologie CRISPR/Cas9 jsme cíleně inaktivovali gen PLK3 v lidských RPE buňkách a paralelně rovněž potlačili expresi PLK3 pomocí RNA interference. Hlavním pozorováním bylo zjištění, že PLK3 není nezbytná pro kontrolu buněčné odpovědi na poškození DNA, hypoxii a osmotický stres. Metodou hmotnostní spektrometrie jsme identifikovali fosfatázu PP6 a její regulační podjednotky PPP6R1 a PPP6R3 jako nové interakční partnery PLK3. Dále jsme pozorovali, že PLK3 je fosforylována na konzervovaném zbytku Thr219 a že deplece PP6 zvyšuje úroveň fosforylace PLK3 ovšem bez vlivu na její enzymatickou aktivitu. Tyto výsledky naznačují možnou regulaci funkce PLK3 prostřednictvím PP6 a biologická relevance tohoto pozorování bude předmětem dalšího studia. Dále jsme provedli transkriptomovou analýzu v lidských RPE-FUCCI buňkách s cílem nalézt potencionální nové regulátory buněčného cyklu. V dalším studiu jsme se zaměřili na Family...
|
|
|
Molecular mechanisms of checkpoint signalling and termination
Benada, Jan ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent) ; Truksa, Jaroslav (oponent)
Pro udržení integrity genomu využívají buňky extensivní signální síť nazývanou buněčná odpověď na poškození DNA (DNA damage response). DDR je schopná aktivovat kontrolní body buněčného cyklu (checkpoints), které brání dalšímu průchodu buněčným cyklem a umožňují buňce opravit poškozenou DNA. Poruchy těchto ochranných mechanismů se projevují závažnými lidskými onemocněními, především rozvojem rakoviny. Cílem teto práce je přispět k porozumění toho jak buňky negativně regulují DDR a signalizaci kontrolních bodu buněčného cyklu. Zaměřili jsme se zejména na fosfatázu Wip1 (PPM1D), která je hlavním negativním regulátorem DDR a je nezbytná pro zotavení z kontrolních bodu. Nejprve jsme ukázali, že Wip1 je degradovaná během mitózy APC- Cdc20-dependetním mechanismem. Wip1 je dále v průběhu mitózy fosforylována na několika aminokyselinách, což vede k inhibici její enzymatické aktivity. Navrhujeme, že inhibice Wip1 umožňuje buňkám adekvátně reagovat i na nízkou hladinu poškození DNA, ke kterému dochází i při nenarušené mitóze. V následující publikaci jsme se zabývali tím, proč mitotické buňky spouštějí pouze časnou DDR a nepokračují k akumulaci opravných faktoru jako je 53BP1. Ukázali jsme, že 53BP1 je fosforylován kinázami CDK1 a Plk1 uvnitř motivu, který je zodpovědný za jeho vazbu na ubiquitin. Tyto...
|
|
|
Potenciální využití WIP1 fosfatasy v terapii nádorového onemocnění prsu
Pecháčková, Soňa ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Souček, Pavel (oponent) ; Krejčí, Lumír (oponent)
(Czech) Buňky našeho těla reagují na genotoxický stres aktivací signální dráhy, která se nazývá buněčná odpověď na poškození DNA (DNA damage response; DDR). V závislosti na typu poškození DNA, DDR dráha vede k dočasnému zastavení buněčného cyklu v kontrolních bodech (tzv. checkpointech), trvalému zastavení růstu (senescence) nebo k programované buněčné smrti (apoptóza). Aktivace kontrolních bodů buněčného cyklu brání progresi buněk a usnadňuje opravu poškozené DNA. DDR představuje bariéru před nárůstem genomové nestability a chrání buňky před vznikem rakoviny. WIP1 (kódovaná genem PPM1D) fosfatasa je hlavním negativním regulátorem DDR dráhy a je nezbytná pro ukončení kontrolních bodů buněčného cyklu. Tato práce přispěla k pochopení molekulárních mechanismů funkce WIP1 fosfatasy a popisuje, jak může být WIP1 fosfatasa zapojena při vzniku nádorů. Nejprve jsme popsali, že hladina WIP1 klesá během mitózy pomocí APC-Cdc20 komplexu, který způsobuje proteasomální degradaci proteinu. WIP1 je v průběhu mitózy fosforylovaná na několika aminokyselinách, což vede k inhibici její enzymatické aktivity. Navrhujeme, že inhibice WIP1 v mitóze umožňuje reagovat na nízkou hladinu DNA poškození, ke které dochází v průběhu nenarušené mitózy. Dále jsme identifikovali nové aktivační (gain-of-function) mutace genu PPM1D,...
|
|
|
53BP1 a jeho role v buněčné odpovědi na dvouvláknové zlomy DNA
Liďák, Tomáš ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Rösel, Daniel (oponent)
Poškození genetické informace uložené v molekulách DNA podmiňuje řadu patologických stavů včetně nádorového bujení a stárnutí. Evolučně konzervované mechanismy opravy DNA brání nahromadění mutací a rozvoji genomové nestability. 53BP1 (tumor suppressor p53-binding protein 1) je důležitý regulátor buněčné odpovědi na dvouvláknové zlomy DNA, který se po vystavení buňky ionizujícímu záření stává součástí fokusů obklopujících vzniklé zlomy DNA. Funkce 53BP1 v buněčné odpovědi na poškození DNA byly objasněny až v nedávně době. Zatímco v drahách signalizujících vznik dvouvláknových zlomů kontrolním bodům buněčného cyklu hraje 53BP1 jen nepatrnou roli, ukázal se být nepostradatelný při určování typu opravy části těchto zlomů. Opravy DNA jsou ovlivněny 53BP1 v několika případech. Kontroluje resekci konců DNA, umožňuje opravy DNA v heterochromatinu, zvyšuje mobilitu nechráněných telomer a zprostředkovává synapse konců DNA během V(D)J rekombinace a izotypového přesmyku. 53BP1 negativně ovlivňuje opravu DNA v nádorových buňkách s poškozeným BRCA1 (breast cancer type 1 susceptibility protein), což může mít vliv na terapeutickou odpověď u některých nádorů prsu. Cílem této bakalářské práce je shrnout nové poznatky o roli 53BP1 v buněčné odpovědi na dvouvláknové zlomy DNA. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Role of RAD18 in ubiquitin signaling at DNA double-strand breaks
Palek, Matouš ; Macůrek, Libor (vedoucí práce) ; Čermák, Lukáš (oponent)
RAD18 je E3 ubikvitin ligáza, která se podílí na ochraně replikační vidličky před kolapsem způsobeným poškozenou DNA. Narušená funkce tohoto důležitého faktoru regulujícího replikaci byla popsána v souvislosti s některými lidskými nádory. Klinická relevance těchto zjištění však není známá. Cílem této práce bylo zhodnocení vybraných RAD18 variant nalezených u pacientů s nádory prsu a ovarií. Její výsledku ukazují, že RAD18 varianty vykazují defekty nejen v ochraně replikační vidličky, ale i v opravě dvouřetězcových zlomů. U této nekonvenční role RAD18 se ví, že je závislá na činnosti dalších ubikvitin ligáz, jak ale přispívá k samotné opravě zůstává záhadou. Dalším cílem této práce proto bylo osvětlení funkce RAD18 v opravě dvouřetězcových DNA zlomů homologní rekombinací s důrazem na jeho vztah s 53BP1. Výsledná data ukazují, že RAD18 kompetuje s 53BP1 o stejné vazebné místo a efektivně brání jeho akumulaci na poškozenou DNA, čímž podporuje resekci DNA. Tato antagonistická funkce RAD18 je vymezená jak prostorově (do okolí opravného centra) tak i časově (do S fáze). Navíc se zdá, že je regulovaná existencí dvou RAD18 komplexů. Potenciální modely vysvětlující tuto regulaci jsou diskutovány na konci této práce. Klíčová slova: RAD18, oprava dvouřetězcových zlomů, ubikvitinace, nádorové varianty, resekce...
|
|
|
Studium úlohy genetických faktorů v prognóze a predikci účinku chemoterapie u pacientek s karcinomem prsu
Brynychová, Veronika ; Souček, Pavel (vedoucí práce) ; Macůrek, Libor (oponent) ; Stružinská, Ivana (oponent)
Změny v regulaci apoptózy a buněčného cyklu se uplatňují při vzniku nádoru, při jeho progresi i při rezistenci k protinádorové léčbě. Cílem této práce bylo stanovit význam kaspáz buněčné smrti a regulátorů cytokineze jako možných prognostických a prediktivních markerů u pacientek s karcinomem prsu. Kromě stanovení transkriptu vybraných genů v nádorových a kontrolních tkáních získaných od pacientek s karcinomem prsu jsme se zaměřili na význam alternativních sestřihových variant kaspáz a jejich potenciální geneticky podmíněnou regulaci. Získaná data jsme hodnotili v souvislosti s klinicko-patologickou charakteristikou nádorů, délkou přežívání pacientek bez návratu onemocnění a s odpovědí pacientek na neoadjuvantní chemoterapeutickou léčbu. Součástí práce bylo stanovení expresních hladin na proteinové úrovni a ověření významu vybraných kandidátů pro účinek chemoterapie pomocí funkční studie. Hladiny transkriptu kaspáz 2, 3, 7, 8, 9 a 10, specificky detekovaných sestřihových variant kaspáz 2S, 2L, 3A a B, 3S, 9A, 9B a 8L, a hladiny transkriptu regulátorů cytokineze KIF14 a CIT v karcinomech prsu nesouvisely s délkou bezpříznakového přežívání pacientek ani s odpovědí pacientek na neoadjuvantní léčbu. Zvýšená exprese alternativní antiapoptické varianty kaspázy 9B na úkor hlavní proapoptické varianty 9A,...
|
host ::
RSS.