|
|
Modulace synaptického přenosu nociceptivní informace
Nerandžič, Vladimír ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Hejnová, Lucie (oponent)
Modulace synaptického přenosu v zadních rozích míšních představuje důležitou součást rozvoje a udržování patologických bolestivých stavů. Nezastupitelnou roli v této modulaci hrají tzv. transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) a kanabinoidní receptory 1 (CB1) exprimované na presynaptických zakončeních primární aferentů. Za fyziologických podmínek jsou TRPV1 receptory pronociceptivní, zatímco CB1 receptory tlumí nociceptivní signalizaci. Oba receptory však sdílejí stejného endogenního agonistu anandamid (AEA), který je syntetizován z N-arachidonoylfosfatidylethanolaminu (20:4-NAPE). Tato práce se zaměřuje především na účinek aplikace 20:4-NAPE za kontrolních podmínek a po navození periferního zánětu a na související možnou interakci mezi TRPV1 a CB1 receptory. První pokusy prokázaly výrazné zvýšení hladiny anandamidu za podmínek in vitro z míšních řezů po aplikaci 20:4-NAPE, jeho prekurzoru. Další experimenty byly prováděny snímáním excitačních postsynaptických proudů (mESPC a sEPSC) v superficiálních neuronech zadních rohů míšních na akutních míšních řezech metodou patch-clamp. Aplikace 20:4-NAPE vedla k výraznému poklesu frekvence mEPSC a sEPSC proudů. Za kontrolních podmínek byl tento pokles frekvence po aplikaci 20:4-NAPE blokován aplikací inhibitorů CB1...
|
|
|
Studium molekulárních mechanismů funkce 14-3-3 proteinů
Šilhán, Jan ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Závěr Hlavním cílem této doktorské práce bylo objasnění molekulárních mechanismů funkce 14-3-3 proteinů a vlivu na proteiny FOXO4 a tyrosinhydroxylasu. V první časti této práce (publikace I) byla potvrzena předložená hypotéza polohy Cterminálního konce molekuly 14-3-3. Bylo ukázáno, že v nepřítomnosti ligandu se Cterminální konec nachází ve vazebném místě a brání tak vstupu ligandů. Po vazbě fosforylovaných ligandů, dochází k velmi silné vazbě a vytěsnění C-terminálního konce 14-3- 3 proteinu z vazebného místa. Tyto výsledky jsou v souladu s původními pracemi, které navrhly důležitost tohoto segmentu jako inhibitoru nepatřičných ligandů. Druhá část této doktorské práce poskytuje rozsáhlý popis vlivu 14-3-3 proteinů na transkripční faktory FOXO4. S použitím stacionární a časově-rozlišené fluorescence byla studována interakce 14-3-3 proteinu s fosforylovaným transkripčním faktorem FOXO4. Navázání 14-3-3 proteinu způsobuje rozpad komplexu FOXO4:DNA. Tato část práce charakterizuje interakci 14-3-3 proteinu s DNA-vazebnou doménou FOXO4. Výsledky neprokázaly výrazné konformační změny v rámci DNA-vazebné domény. Spíše dochází ke sterickému bránění vazby DNA (publikace II). Ve třetí části se práce zabývá studiem interakcí 14-3-3 s fosforylovaným ligandem odvozeným od C-konce enzymu serotonin N-acetyltransferasa...
|
|
| |
|
| |
|
|
Characterization of native and heterologously expressed membrane transporters in yeast using fluorescent probes
Zahumenský, Jakub ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Cebecauer, Marek (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
Transportéry plasmatické membrány kvasinekhrají důležitou úlohu v mnoha buněčných dějích. Mezi tyto děje patří například detoxikace a budování a udržování membránového potenciálu (ΔΨ). Metoda využívající fluorescenční sondu diS-C3(3) vyvinuta na Oddělení biofyziky Fyzikálního ústavu Univerzity Karlovy nám umožnila pohodlně studovat obojí a je zároveň vhodným nástrojem pro sledování změn těchto důležitých parametrů. Mnohé studie jak na živočišných buňkách, tak i na kvasinkách, ukázali, že etanol a jiné alkoholy inhibují funkci různých membránových kanálů, receptorů a specifických transportérů. Jako mechanismus účinku byla uvažována přímá interakce alkoholů s těmito membránovými proteiny. V naší studii jsme pro identifikaci inhibitorů pump mnohočetné lékové rezistence použili metodu s fluorescenční sondou diS-C3(3) a sadu kvasinkových kmenů s delecí genů PDR5 a SNQ2. Zjistili jsme, že pumpy kódované těmito dvěma geny jsou inhibovány n-alkoholy (od etanolu po hexanol). Ukázali jsme, že inhibiční účinek roste s délkou uhlovodíkového řetězce alkoholů, nesouvisí s poškozením plasmatické membrány a je plně revezibilní. Tyto zjištění napovídají, že studovaný inhibiční účinek nemusí nutně zahrnovat jenom změny lipidové matrice plasmatické membrány, ale může být způsoben také přímou interakcí alkoholů s pumpami....
|
|
|
Studium membránových transportních procesů u kvasinek pomocí potenciometrické fluorescenční sondy diS-C3(3)
Bartl, Tomáš ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Název práce: Studium membránových transportních procesů u kvasinek pomocí potenciometrické fluorescenční sondy diS-C3(3) Autor: Tomáš Bartl Katedra / Ústav: Fyzikální ústav UK Vedoucí bakalářské práce: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc., Fyzikální ústav UK Abstrakt: V membránách kvasinek existuje celá řada transportérů. Některé jsou zodpovědné za přísun živin do buněk, jiné za vylučování odpadních a cizorodých látek ven z buněk nebo za transport malých anorganických iontů a protonů přes membránu. V této práci byla studována činnost specifických transportních proteinů, tzv. MDR pump, které jsou zodpovědné za odstraňování cizorodých látek/léků z buněk. Pomocí série mutantních kmenů kvasinek Saccharomyces cerevisiae (AD12, AD1-3 a AD1-8) lišících se zastoupením jednotlivých MDR pump v jejich plazmatické membráně byl zkoumán vliv různých chemických látek na změnu intracelulární koncentrace potenciometrické fluorescenční sondy diS-C3(3), která je aktivně odstraňována z buněk některými z těchto pump. Sledováním účinku glukózy a 2-deoxyglukózy byl prokázán aktivní příspěvek nejenom hlavní MDR pumpy, Pdr5p, ale také dalších pump ke snižování intracelulární koncentrace sondy. Bylo zjištěno, že zatímco glukóza zvyšuje aktivitu těchto pump při odstraňování sondy z cytosolu, přidání 2-deoxyglukózy způsobuje naopak jejich...
|
|
|
The role of spinal TRPV1 receptors in nociceptive signalling and the modulatory effect of chemokine CCL2 and µ-opioid receptor agonists
Šulcová, Dominika ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
První synapse nociceptivní dráhy v zadním rohu míšním představuje významné místo pro modulaci nociceptivní signalizace za patologických stavů. Jedním z modulačních mechanizmů jsou změny funkce receptoru TRPV1 (transient receptor potential vanilloid 1), který je exprimován na centrálních zakončeních nociceptivních neuronů a svou činností přímo reguluje výlev neuropřenašečů a neuromodulátorů. Předchozí studie ukázaly úlohu TRPV1 v účincích zánětlivého chemokinu CCL2 (C-C motif ligand 2) a po aktivaci µ-opioidního receptoru (MOP-R) na míšní úrovni. Protože receptory CCR2 (aktivovány CCL2), TRPV1 a MOP-R často kolokalizují v neuronech spinálních ganglií, cílem tohoto projektu bylo studovat jejich možné intreakce při modulaci nociceptivního přenosu v míše. Tato diplomová práce se zabývala zejména vlivem chemokinu CCL2 na senzitizaci spinálních TRPV1 u modelu periferní neuropatie a jeho vlivem na synaptický přenos po aktivaci µ-opioidních receptorů. Ke studiu synaptického přenosu bylo využito snímání excitačních postsynaptických proudů (EPSC) pomocí metody patch-clamp z povrchových neuronů zadního rohu míšního na řezech lumbární míchy potkana. U těchto neuronů byla v závěru experimentu prokázána přítomnost TRPV1 pozitivních synapsí pomocí aplikace kapsaicinu. V první části experimentu byla měření...
|
|
|
Interakce glutamátových receptorů kainátového typu se steroidními látkami
Fraňková, Denisa ; Krůšek, Jan (vedoucí práce) ; Adámek, Pavel (oponent)
Kainátové receptory patří do rodiny glutamátových receptorů, mezi které se řadí také NMDA, AMPA a δ receptory. Glutamátové receptory se hojně vyskytují v mozku, a proto se velmi dynamicky zkoumají a to především z hlediska farmakologie, neboť se vkládá velký potenciál do hledání nových a úzce specifických modulátorů, které by se mohly využít v léčbě neurodegenerativních onemocnění. Cílem této práce bylo rozšířit poznatky o vlivu neurosteroidů na homomerní kainátové receptory (GluK1, GluK2, GluK3), u kterých je zkoumání modulace prostřednictvím neurosteroidů teprve v začátcích. Interakci homomerních kainátových receptorů s vybranými neurosteroidy (pregnenolon sulfát, pregnanolon sulfát, dehydroepiandrosteron, dehydroepiandrosteron sulfát) jsme zkoumali pomocí metody terčíkového zámku v konfiguraci měření proudů z celé buňky a také pomocí mikrospektrofluorimetrické metody. Zjistili jsme, že největší modulační efekt na homomerní kainátové receptory způsobuje pregnenolon sulfát, který inhibuje odpověď těchto receptorů na agonistu glutamát. Klíčová slova kainátový receptor, glutamát, neurosteroidy, steroidy, metoda terčíkového zámku
|
|
|
Role segmentu 400-500 v biologické aktivitě adenylát cyklázového toxinu bakterie Bordetella pertussis
Suková, Anna ; Mašín, Jiří (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Adenylát cyklázový toxin-hemolyzin (CyaA) je RTX protein, který hraje zásadní roli ve virulenci bakterie Bordetella pertussis, způsobující onemocnění černý kašel. CyaA dopravuje do cytosolu CD11b+ fagocytů svou enzymatickou adenylát cyklázovou doménu a katalyzuje přeměnu ATP na cAMP, které následně zablokuje baktericidní funkce fagocytů. Současně toxin vytváří v membráně cílových buněk póry, způsobující únik draselných iontů z buňky. Cílem této diplomové práce bylo analyzovat mechanizmus interakce domény spojující invazivní adenylát cyklázovou (AC) doménu a tzv. RTX hemolyzin s biologickou membránou. Z našich výsledků vyplývá, že tato doména interaguje s cílovou membránou a hraje zásadní roli v tvorbě malých pórů selektivních pro kationty. Získané výsledky budou zásadní pro pochopení interakce bakteriálních toxinů s cílovou membránou a naleznou reálné použití při vývoji terapeutických vakcín odvozených od CyaA. Klíčová slova: Bordetella pertussis, adenylát cyklázový toxin, translokace přes membránu, pórotvorná aktivita, černé lidipové membrány, liposomy
|
|
|
Charakterizace vazebných míst na intracelulárních koncích TRPC6 receptoru pro kalmodulin a S100A1
Bílý, Jan ; Teisinger, Jan (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Charakterizace vazebných míst pro kalmodulin a S100A1 na intracelulárních koncích TRPC6 receptoru Skupina TRP (transient receptor potential) iontových kanálů je rozsáhlou třídou membránových receptorů. Součástí této skupiny jsou i kanonické kanály TRPC se sekvencí analogickou TRP kanálům poprvé objevených u octomilky (Drosophila melanogaster). Tyto membránové kanály jsou zapojeny do mnoha fyziologických procesů v různých typech buněk a tkání. TRPC6 je neselektivní kationtový kanál, který řídí intracelulární rovnováhu vápenatých iontů eukaryotických buněk (včetně senzorických a receptorových buněk) jako odpověď na vnější podněty. TRPC6 obsahuje vazebnou doménu CIBR (Calmodulin inositol binding region), který je schopen vázat vápník vázající protein S100A1. Cílem práce je charakterizace vazebného místa CIBR lokalizovaného na C intracelulárním konci TRPC6 pro kalmodulin (CaM) a S100A1. Pomocí bodové mutace byl připravený rozpustný proteinový fragment TRPC6 CT (801-878) se záměrně vyměněnými aminokyselinami. V případě některých vybraných bazických aminokyselin (Arg852, Lys856, Lys859, Arg860 a Arg864) nesoucích pozitivní náboj byl měřením anizotropie fluorescence potvrzen jejich vliv a účast na tvorbě komplexu TRPC6 s CaM i S100A1. Obě interakce jsou závislé na přítomnosti Ca2+ iontů. Homologní model...
|
host ::
RSS.