|
|
Intracellular and intercellular regulation of gene expression in Gram-positive bacteria.
Pospíšil, Jiří ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent) ; Malínský, Jan (oponent)
Bakterie patří mezi nejčetnější organismy na Zemi a jsou součástí našeho každodenního života. Symbiotické bakterie, které se nachází například v trávicím traktu živočichů, mají většinou příznivý vliv na organismus. Existují však také patogenní druhy bakterií, které jsou původci méně či více závažných onemocnění po celém světě. Abychom mohli s patogeny účinně bojovat, je zapotřebí co nejvíce pochopit strategie chování bakteriální populace a molekulární mechanismy, kterými tyto organismy reagují na okolní prostředí. Práce je rozdělena na dvě hlavní části. První část charakterizuje bakteriální genovou expresi v modelových organismech Bacillus subtilis a Mycobacterium smegmatis. DNA-dependentní RNA polymeráza (RNAP) je enzym zodpovědný za přepis nukleových kyselin (z DNA do RNA) a má tedy klíčovou roli v expresi genů. V Disertační práci je řešena struktura RNAP a důležité faktory (proteiny, nebo RNA), které s tímto enzymem asociují a ovlivňují jeho funkci. Druhá část je zaměřena na bakteriální mezibuněčnou komunikaci a faktory/mechanismy (zahrnující genovou expresi), které tento proces ovlivňují. Jeden z typů bakteriální komunikace je označen jako bakteriální nanotrubičky (NT). NT byly v minulosti popsány jako mezibuněčné kanály, kterými si bakterie mohou předávat metabolity, mRNA, proteiny a dokonce...
|
|
|
Clostridium difficile: Molekulární typizace klinicky významných izolátů
Krůtová, Marcela ; Nyč, Otakar (vedoucí práce) ; Čermák, Pavel (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Clostridium difficile je významným nozokomiálním patogenem současnosti v souvislosti s rozšířením epidemických kmenů. Molekulární typizace klinických izolátů je nedílnou součástí kontroly výskytu a šíření C. difficile v nemocničním prostředí a v komunitě. Soubor 2201 klinických izolátů C. difficile z 32 nemocničních zařízení z období 2013-2015 byl charakterizován pomocí PCR ribotypizace doplněné o průkaz genů pro tvorbu toxinů. Identifikovali jsme celkem 166 různých ribotypizačních profilů a u 53 profilů byly zachyceny alespoň dva izoláty reprezentující jeden profil. Nejčastěji zachycenými ribotypy byly 176 (n=588; 26,7 %) a 001 (n=456; 20,7 %), následovány ribotypy 014 (n=176; 8 %), 012 (n=127; 5,8 %), 017 (n=85; 3,9 %) a 020 (n=68; 3,1 %). Celkem 2024 (92 %) izolátů bylo toxigenních (neslo geny pro produkci toxinů A, B) a z těchto navíc 677 neslo také geny pro tvorbu binárního toxinu. Zbývajících 177 (8 %) izolátů bylo netoxigenních. Subtypizace izolátů C. difficile pomocí MLVA (multilocus variable number tandem repeats analysis) porovnávající počet repetitivních úseků byla provedená u izolátů ribotypu 176 (n=225, 17 nemocnic) a u izolátů ribotypu 001 (n=184, 14 nemocnic) kultivovaných v roce 2014. Klonální příbuznost izolátů v rámci ribotypu byla zjištěna u 76,6 % izolátů ribotypu 001, které...
|
|
|
Analysis and mapping of binding sites of gene expression regulators in the genus of Streptomyces.
Šmídová, Klára ; Bobek, Jan (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Kopecký, Jan (oponent)
Streptomycety jsou lékařsky důležité bakterie žijící v půdě, které podléhají morfologickým změnám od spór po vzdušné hyfy a jsou důležitými producenti bioaktivních látek včetně antibiotik. Jejich genová exprese je přísně regulována v časných úrovních transkripce a translace. Během řízení transkripce hrají sigma faktory ústřední roli; modelový organismus Streptomyces coelicolor má ohromujících 65 sigma faktorů. Exprese sigma faktorů samotných je řízena na post-transkripční úrovni působením malých RNA molekul, které modifikují hladinu jejich messengerových RNA. Avšak pouze několik sigma faktorů ve streptomycetách má známé regulony a také jejich regulace prostřednictvím malých RNA molekul nebyla dosud studována. V závislosti na předtím naměřených datech o genové expresi jsme vybrali několik vysoce exprimovaných sigma faktorů. Pomocí mutantních kmenů nesoucích sigma faktory značené HA tagem byly analyzovány regulony dvou důležitých sigma faktorů, SigQ a HrdB, pomocí techniky ChIP-seq. Další sigma faktory byly dále studovány pomocí metody 5 ' a 3' RACE a Northern blottingu, aby se zjistilo, zda mají asRNA. Naše data potvrzují nezbytnost sigma faktoru HrdB během vegetativní fáze růstu. Ukázalo se, že druhý sigma faktor, SigQ, je důležitým regulátorem metabolismu dusíku a regulátorem reakce na osmotický...
|
|
|
The role of elF3 a Rps3 in stop codon readthrough
Poncová, Kristýna ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Translace představuje složitě regulovaný a vysoce provázaný proces výroby proteinů v buňce. Má několik základních fází-iniciaci, elongaci, terminaci a recyklaci ribosomů. Naše laboratoř se zabývá studiem multifaktoriálního komplexu eukaryotického iniciačního faktoru 3 (eIF3). Zajímá nás nejen odhalování jeho molekulárních rolí v průběhu translačního cyklu, ale také jeho úloha při specifických mechanismech, které se podílí na regulování translace v závislosti na buněčných potřebách. eIF3 se skládá v kvasinkách z pěti esenciálních podjednotek (a/Tif32, b/Prt1, c/Nip1, g/Tif35 a i/Tif34). V savcích je jeho složení komplexnější s 12 podjednotkami (a-i, k-m). eIF3 je klíčový hráč nejen v iniciaci translace, ale také ve fázi recyklace ribosomů a překvapivě i v translační terminaci a pročítání stop kodonu. Posledně zmiňovaný proces má velký klinický potenciál, jelikož téměř 1/3 geneticky podmíněných onemocnění je způsobena přítomností předčasného terminačního kodonu v protein kódující oblasti. Porozumění molekulárním detailům pročítání stop kodonu a translačně terminační mašinérie je důležité pro další vývoj selektivních a méně toxických léčiv vhodných k terapii. V této disertační práci jsem popsala jak protein malé ribosomální podjednotky Rps3 řídí efektivitu rozpoznávání stop kodonu. Identifikovala jsem...
|
|
|
Regulace mykobakteriální transkripce
Kafka, Vojtěch ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Dostálová, Hana (oponent)
RNA polymeráza (RNAP) je enzym katalyzující syntézu RNA řetězce a uplatňuje se jako hlavní enzym transkripce. RNAP u mykobakterií je odlišná od ostatních bakteriálních RNA polymeráz. Pro svoji funkci vyžaduje speciální transkripční faktory, jako jsou RbpA nebo CarD. Zároveň se na mykobakteriální RNA polymerázu váže malá RNA (sRNA) Ms1, která reguluje množství polymerázy v buňce. V naší laboratoři byl také objeven protein MoaB2 jako nový vazebný partner interagující s mykobakteriální A (gen sigA), podjednotkou RNAP, významnou pro rozpoznání počáteční sekvence promotoru a iniciaci transkripce. Funkce MoaB2 v regulaci transkripce a genové exprese je doposud neznámá. Prvním cílem této diplomové práce je přispět k objasnění mechanismu, jakým Ms1 reguluje množství RNAP. Výsledky ukázaly, že tato regulace je na úrovni transkripce a to na úrovni ovlivnění aktivity promotorů řídících expresi rpoB-rpoC, které kódují katalytické podjenotky RNAP. Druhým cílem této práce je charakterizovat interakce MoaB2 s proteiny transkripčního aparátu. Výsledky potvrdily interakci MoaB2 se A a k této interakci není potřebná ani RNAP ani transkripční faktory RbpA a CarD. Role N-terminální domény A pro interakci s MoaB2 nebyla prozatím potvrzena. Shrnuto, tato práce významně přispívá k našemu pochopení mykobakteriálního...
|
|
|
The effect of selected endogenous and exogenous factors on bacterial growth
Šiková, Michaela ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Valášek, Leoš (oponent) ; Vopálenský, Václav (oponent)
Růst bakteriální kultury binárním dělením je klíčovou charakteristikou těchto organismů. Tento růst závisí na dvou typech faktorů: endogenní a exogenní. Endogenní faktory tvoří molekulární aparát buněk. Mezi důležité endogenní faktory patří rovněž ty, které se podílejí na genové expresi a její regulaci. Mezi exogenní faktory řadíme dostupnost živin, teplota, pH, různé stresy nebo přítomnost antibiotik. Hlavním cílem mé dizertační práce bylo studium vlivů vybraných endogenních a exogenních faktorů na bakteriální růst. Jako endogenní faktory jsem studovala RNázu J1 u Bacillus subtilis a malou RNA zvanou Ms1 u Mycobacterium smegmatis, které se podílejí na regulaci genové exprese na úrovni transkripce. Ukazuji zde, že RNáza J1 může, kromě své role v degradaci RNA, hrát roli v genomové integritě odstraněním zastavených komplexů RNA polymerázy (RNAP) z DNA. Dále ukazuji, že Ms1 se váže na jádro RNAP a má vliv na množství RNAP v buňce. Výsledky odhalují nové mechanistické aspekty transkripčního aparátu a ukazují, jak jednotlivé komponenty nebo kombinace ovlivňují bakteriální růst. Jako exogenní faktory jsem studovala nedávno objevené antibakteriální látky zvané lipofosfonoxiny a jejich interakci s bakteriemi, bakteriálními proteiny a vliv na bakteriální růst. Stručně řečeno, tato práce posouvá naše...
|
|
|
The effect of the environment on bacterial DNA topology and gene expression.
Mikesková, Klára ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Večerek, Branislav (oponent)
Biologické procesy v buňce jsou ovlivněny DNA topologií, tedy strukturou a tvarem DNA. Důležitý topologický ukazatel je úroveň nadšroubovicového vinutí DNA - otáčky DNA navíc jsou uvolňovány pozitivními (otáčení po směru otáčení dvoušroubovice) nebo negativními (otáčení v protisměru) nadobrátkami. V této práci se pojednává o úloze nadšroubovicového vinutí v regulaci genové exprese. Popisuji, jaké je uplatnění nadšroubovicového vinutí v homeostatických mechanismech, které ovládají produkci některých genů na úrovni transkripce. Změny prostředí, jako například změny teploty, oxidativní stres, extrémní pH a antibiotika a jiné inhibitory, ovlivňují úroveň nadšroubovicového vinutí DNA. Nadšroubovicové vinutí DNA poté ovlivňuje expresi enzymů, které ovlivňují DNA topologii, a také další geny a proteiny. Shrnuto, tato práce popisuje, jak změny vnějšího prostředí ovlivňuje DNA topologii a genovou expresi u bakterií se stručnou zmínkou této regulace u eukaryot.
|
|
|
RNA-přepínače jako nástroje regulace genové exprese
Jureček, Matěj ; Folk, Petr (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent)
RNA-přepínače jsou segmenty na 5' UTR nebo v intronech mRNA nebo pre-mRNA, které jsou schopné samy o sobě vázat malou molekulu (většinou metabolit, nukleotid nebo ion) a jako odpověď "přepínat" mezi dvěmi konformacemi, které mohou ovlivnit genovou expresi. Ve většině případů u bakterií mRNA kterou RNA-přepínač reguluje kóduje složku metabolismu ligandu vázajícího se na RNA-přepínač. Na rozdíl od jiných mechanismů regulace genové exprese RNA-přepínače nevyžadují pro regulaci přítomnost proteinů. RNA-přepínače mohou také představovat způsob, jakým hypotetické primitivní formy života regulovaly svou genovou expresi. RNA-přepínače jsou hojné u bakterií a jen málo se jich vyskytuje u eukaryot. Jejich studium se neustále zintenzivňuje a rozšiřuje a dnes by mohly RNA-přepínače lehce představovat samostatné odvětví molekulární biologie.
|
|
|
Rhomboid family intramembrane proteases in prokaryotes: mechanism, substrate repertoires and biological functions in the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis.
Began, Jakub ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
(Czech) Proteázy z rodiny rhomboidů patří do rozsáhlé skupiny serinových intramembránových proteáz, které katalyzují proteolytické štěpení membránových proteinů uvnitř jejich transmembránových oblastí, v hydrofobním prostředí lipidických buněčných membrán. Rhomboidové proteázy byly objeveny v roce 2001 v Drosophila. V průkopnické studii (Lee et al.) byla identifikována zásadní role Rhomboidu-1 (Rhom-1), který v rané fázi vývoje oka octomilky aktivuje signální dráhu receptoru epidermálního růstového faktoru. Rhomboidové proteázy, ať už aktivní proteázy (rhomboidy) či jejich katalyticky neaktivní protějšky (rhomboidové proteiny zahrnující iRhomy a Derliny), jsou silně konzervovány, což naznačuje jejich biologickou významnost. Rhomboidy jsou přítomné napříč živočišnými říšemi, od archea po člověka, zatímco proteolyticky neaktivní rhomboidové proteiny jsou přítomné výlučně v eukaryotních organizmech. Rodina rhomboidových proteinů hraje roli v široké škále rozmanitých biologických procesů, jakými je signalizace ve vývoji metazoí, mitochondriální biogenezi kvasinek, invaze protozoálních parazitů do hostitelských buněk, kvalitativní kontrola proteinů v endoplazmatickém retikulu (ER), či bakteriální quorum sensing. Ze strukturního i mechanistického hlediska jsou rhomboidy nejprostudovanějšími z...
|
|
|
Molecular details of translation reinitiation in budding yeast
Mohammad, Mahabub Pasha ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Mašek, Tomáš (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Eukaryotická iniciace translace je vysoce komplexní proces zahrnující celou řadu fází. Iniciace translace je zahájena sestavením preiniciačního komplexu 43S, který nasedá na 5' čepičku mRNA a následně pročítá mRNA za účelem rozpoznání vhodného AUG start kodónu. Po rozeznání AUG kodónu většina iniciačních faktorů z komplexu 48S disociuje. Některé z těchto faktorů nicméně zůstávají s komplexem 48S přechodně asociované, jedná se například o eIF3 a nejspíše o eIF4G. V rámci této práce jsme vyvinuli metodu RNA-protein Ni2+ -pull down (Rap-Nip), která slouží k in vivo detekci fragmentů mRNA navázaných na eIF3 v kvasinkách. Ukázali jsme, že eIF3 kvasinky Saccharomyces cerevisiae zůstává po iniciaci translace perzistentně navázán na elongujících ribozomech po dobu několika elongačních cyklů. eIF3 navíc stabilizuje post-terminační komplex 40S na stop kodónu krátkých čtecích rámců uORF1 a uORF2 GCN4 a to prostřednictvím kontaktu mezi N-terminální částí podjednotky a/TIF32 a elementy podporujícími reiniciaci (RPEs) příslušného uORF GCN4. S využitím β-galaktosidázového reportérového systému jsme odhalili, že AU- bohatý motiv (motiv AU1-2A/ UUAU2) nacházející se těsně za stop kodonem reiniciačně (REI)-permisivních uORFs podporuje autonomně a místně specificky reiniciaci. Rovněž jsme ukázali, že přesná délka...
|
host ::
RSS.