|
|
Produkce toxinů bakterií Bacillus subtilis a jejich role v konkurenčním boji s dalšími bakteriemi
Šureková, Kristína ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Mikušová, Gabriela (oponent)
Bacillus subtilis je gram pozitivní půdní bakterie, která je v prostředí obklopena mnoha jinými mikroorganismy. Z tohoto důvodu je potřebné, aby byla bakterie schopná soutěžit s těmito mikroorganismy o živiny a životní prostor. B. subtilis má ve své genetické výbavě moduly, které ji pomáhají v konkurenceschopnosti. Tyto moduly jsou označeny jako toxin- antitoxin systémy. Tato diplomová práce je zaměřena na identifikaci dosud nepopsaných extracelulárních toxinů, produkovaných divokým kmenem B. subtilis BSB1. Jako konkurenční bakterie byl použit příbuzný mikroorganismus Bacillus megaterium. Na tomto systému byl demonstrován kontakt závislý a nezávislý způsob usmrcení konkurenční bakterie. Pomocí delečních analýz a porovnání genomů divokých kmenů B. subtilis byl zprvu identifikován profág SPβ jako oblast, která obsahuje neznámý toxin(y). Analýzou extracelulárního proteomu B. subtilis bylo následně odhaleno, že toxin (případně toxinový komplex) dosahuje molekulové hmotnosti přesahující 100 kDa. O to více bylo fascinující zjištění, že je takto veliká proteinová molekula odolná vůči působení pankreatické proteázy, trypsinu. Následné neenzymatické bromkyanové štěpení extracelulárních proteinů a jejich analýza hmotnostní spektrometrií odhalily potenciální toxinové kandidáty, které se nacházejí na profágu...
|
|
|
Mechanizmus účinku a podstata rozdílné citlivosti bakterií k antibakteriálním látkám lipofosfonoxinům
Havlová, Noemi ; Mikušová, Gabriela (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent)
Lipofosfonoxiny (LPPO) jsou syntetické antimikrobiální látky, jejichž zásahovým místem je cytoplazmatická membrána. I. generace LPPO je účinná proti Gram pozitivním bakteriím, nicméně nevykazuje aktivitu proti Gram negativním bakteriím. Po modifikaci iminocukrového modulu, nosiče pozitivního náboje, vznikla II. generace LPPO, která vykazuje rozšířené účinky proti Gram pozitivním bakteriím a je aktivní i proti Gram negativním, včetně multirezistetních kmenů. Tato práce se zaměřuje na mechanizmus účinku LPPO - zkoumá pórotvornou aktivitu těchto látek na modelových membránách i in vivo. Dále se zabývá podstatou rozdílné aktivity proti Gram pozitivním a Gram negativním bakteriím na modelových bakteriích Bacillus subtilis a Escherichia coli. Výsledky ukazují, že důvodem necitlivosti Gram negativních bakterií k LPPO I. generace, je pravděpodobně jiná stavba buněčné stěny a přítomnost vnější membrány, kterou nejsou schopné překonat. Vliv na antimikrobiální aktivitu LPPO má také fosfolipidové složení cílové cytoplazmatické membrány. Vyšší podíl fosfolipidů s neutrálním nábojem způsobuje sníženou pórotvornou aktivitu u bakterií, ale také stojí za nízkou cytotoxicitou proti eukaryotickým buňkám. Klíčová slova: Antimikrobiální peptidy, lipofosfonoxiny, pórotvorná aktivita, cytoplazmatická membrána, Bacillus...
|
|
|
SigN from Bacillus subtilis: Functional characterization.
Kambová, Milada ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Nešvera, Jan (oponent)
Bacillus subtilis kmen 3610 je ancestrální nedomestikovaný kmen. Liší se od labora- torního kmene 168 v mnoha ohledech. Jedna z odlišností v kmeni 3610 je přítomnost plasmidu pBS32 kódujícího sigma factor N (σN). Tento σ faktor je aktivovaný po poškození DNA, a jeho exprese indukuje buněčnou smrt. Cíle této práce byla sys- tematická charakterizace transkripce tohoto nového σ faktoru. Za prvé jsem ukázala, že pouze predikované promotory na plasmidu, ne na chromosomu, byly aktivní v in vitro transkripcích. Dále jsem určila anitu RNAP se σN k DNA a iniciační NTP (iNTP) jak na relaxované, tak na DNA s nadšroubovicovým vinutím. Aktivita RNAP na relaxovaných σN-dependentních promotorech byla překvapivě vyšší než na promo- torech v DNA s nadšroubovicovým vinutím, což je protikladem k RNAP asociovaných s jinými σ faktory. Tato vlastnost σN-dependentních promotor· nebyla kódovaná v promotorovém jádře. Shrnutě, tato práce přispěla k našemu pochopení bakteriální transkripce. 1
|
|
|
Regulation of transcription in Gram-positive bacteria
Rabatinová, Alžběta ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Bobek, Jan (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
Bakterie patří mezi nejrozšířenější organizmy na světě. Žijí ve všech prostředích, včetně těch nejextrémnějších. Všechny suchozemské a vodní ekosystémy jsou závislé na jejich aktivitě. Bakterie plní nezbytnou úlohu při recyklaci živin, jako jsou uhlík, dusík a síra. Z důvodu jejich krátkého životního cyklu se musí rychle a adekvátně přizpůsobovat podmínkám okolí. Mikrobiální růst je autokatalytický proces. Růstová křivka bakterií má tři základní fáze: lag fáze, exponenciální fáze a stacionární fáze. Bakteriální buňka musí při přechodu mezi těmito fázemi přizpůsobovat genovou expresi pro adaptaci k novým podmínkám. Prvním krokem genové exprese je transkripce. Klíčovou úlohu v tomto procesu hraje RNA polymeráza (RNAP), která přepisuje DNA do RNA. RNAP je regulována řadou dalších proteinů a taktéž malými molekulárními efektory. Abychom pochopili, jak se bakterie přizpůsobují svému okolí, musíme pochopit jak RNAP a její regulace fungují. Tato disertační práce studuje vybrané aspekty genové regulace na úrovni transkripce. Modelovým organismem je Bacillus subtilis. První část disertační práce se věnuje regulaci RNAP prostřednictvím iniciačního nukleosid trifosfátu (iNTP) a identifikuje podjednotku δ jako proteinový faktor důležitý pro tuto regulaci. Je demonstrována funkce tohoto proteinu a jeho...
|
|
|
Factors affecting gene expression in Bacillus subtilis
Sudzinová, Petra ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Vohradský, Jiří (oponent)
Klíčovým enzymem bakteriální transkripce je DNA-závislá RNA-polymeráza (RNAP). Její aktivita musí být přesně kontrolována. Tato kontrola může nastat na úrovni rozeznání různých verzí promotorové DNA, v různém stavu nadšroubovicovitého vinutí. Dále také pomocí změn ve vnitrobuněčné koncentraci metabolitů, nebo pomocí vazby proteinů, které se nazývají transkripční faktory. I když byla RNAP a její regulační síť intenzivně studována po desítky let, stále nové a nové regulátory jsou objevovány. Hlavním cílem této doktorské práce je představit několik z nich: i) HelD, nový protein, který se váže na RNAP, a jehož trojrozměrná struktura zatím není známa; ii) RNázu J1, enzym s novým mechanismem funkce; iii) Spx, důležitý regulátor genové exprese v Bacillus subtilis, jehož všechny funkce zatím nejsou popsány a iv) vliv nadšroubovicovitého stavu promotorové DNA na transkripci. V Publikaci I jsme popsali HelD protein jako nového vazebného partnera RNAP z Bacillus subtilis a charakterizovali jsme jeho biochemické vlastnosti. HelD zvyšuje transkripci tím, že pomáhá recyklovat molekuly RNAP, a tato aktivace je závislá na ATP. V Publikaci III jsme prezentovali první vhled do trojrozměrné struktury HelD pomocí metody SAXS a popsali jsme doménové složení HelD proteinu. A v Publikaci VI jsme vyřešili strukturu...
|
|
|
Intracellular and intercellular regulation of gene expression in Gram-positive bacteria.
Pospíšil, Jiří ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent) ; Malínský, Jan (oponent)
Bakterie patří mezi nejčetnější organismy na Zemi a jsou součástí našeho každodenního života. Symbiotické bakterie, které se nachází například v trávicím traktu živočichů, mají většinou příznivý vliv na organismus. Existují však také patogenní druhy bakterií, které jsou původci méně či více závažných onemocnění po celém světě. Abychom mohli s patogeny účinně bojovat, je zapotřebí co nejvíce pochopit strategie chování bakteriální populace a molekulární mechanismy, kterými tyto organismy reagují na okolní prostředí. Práce je rozdělena na dvě hlavní části. První část charakterizuje bakteriální genovou expresi v modelových organismech Bacillus subtilis a Mycobacterium smegmatis. DNA-dependentní RNA polymeráza (RNAP) je enzym zodpovědný za přepis nukleových kyselin (z DNA do RNA) a má tedy klíčovou roli v expresi genů. V Disertační práci je řešena struktura RNAP a důležité faktory (proteiny, nebo RNA), které s tímto enzymem asociují a ovlivňují jeho funkci. Druhá část je zaměřena na bakteriální mezibuněčnou komunikaci a faktory/mechanismy (zahrnující genovou expresi), které tento proces ovlivňují. Jeden z typů bakteriální komunikace je označen jako bakteriální nanotrubičky (NT). NT byly v minulosti popsány jako mezibuněčné kanály, kterými si bakterie mohou předávat metabolity, mRNA, proteiny a dokonce...
|
|
|
Clostridium difficile: Molekulární typizace klinicky významných izolátů
Krůtová, Marcela ; Nyč, Otakar (vedoucí práce) ; Čermák, Pavel (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Clostridium difficile je významným nozokomiálním patogenem současnosti v souvislosti s rozšířením epidemických kmenů. Molekulární typizace klinických izolátů je nedílnou součástí kontroly výskytu a šíření C. difficile v nemocničním prostředí a v komunitě. Soubor 2201 klinických izolátů C. difficile z 32 nemocničních zařízení z období 2013-2015 byl charakterizován pomocí PCR ribotypizace doplněné o průkaz genů pro tvorbu toxinů. Identifikovali jsme celkem 166 různých ribotypizačních profilů a u 53 profilů byly zachyceny alespoň dva izoláty reprezentující jeden profil. Nejčastěji zachycenými ribotypy byly 176 (n=588; 26,7 %) a 001 (n=456; 20,7 %), následovány ribotypy 014 (n=176; 8 %), 012 (n=127; 5,8 %), 017 (n=85; 3,9 %) a 020 (n=68; 3,1 %). Celkem 2024 (92 %) izolátů bylo toxigenních (neslo geny pro produkci toxinů A, B) a z těchto navíc 677 neslo také geny pro tvorbu binárního toxinu. Zbývajících 177 (8 %) izolátů bylo netoxigenních. Subtypizace izolátů C. difficile pomocí MLVA (multilocus variable number tandem repeats analysis) porovnávající počet repetitivních úseků byla provedená u izolátů ribotypu 176 (n=225, 17 nemocnic) a u izolátů ribotypu 001 (n=184, 14 nemocnic) kultivovaných v roce 2014. Klonální příbuznost izolátů v rámci ribotypu byla zjištěna u 76,6 % izolátů ribotypu 001, které...
|
|
|
Analysis and mapping of binding sites of gene expression regulators in the genus of Streptomyces.
Šmídová, Klára ; Bobek, Jan (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent) ; Kopecký, Jan (oponent)
Streptomycety jsou lékařsky důležité bakterie žijící v půdě, které podléhají morfologickým změnám od spór po vzdušné hyfy a jsou důležitými producenti bioaktivních látek včetně antibiotik. Jejich genová exprese je přísně regulována v časných úrovních transkripce a translace. Během řízení transkripce hrají sigma faktory ústřední roli; modelový organismus Streptomyces coelicolor má ohromujících 65 sigma faktorů. Exprese sigma faktorů samotných je řízena na post-transkripční úrovni působením malých RNA molekul, které modifikují hladinu jejich messengerových RNA. Avšak pouze několik sigma faktorů ve streptomycetách má známé regulony a také jejich regulace prostřednictvím malých RNA molekul nebyla dosud studována. V závislosti na předtím naměřených datech o genové expresi jsme vybrali několik vysoce exprimovaných sigma faktorů. Pomocí mutantních kmenů nesoucích sigma faktory značené HA tagem byly analyzovány regulony dvou důležitých sigma faktorů, SigQ a HrdB, pomocí techniky ChIP-seq. Další sigma faktory byly dále studovány pomocí metody 5 ' a 3' RACE a Northern blottingu, aby se zjistilo, zda mají asRNA. Naše data potvrzují nezbytnost sigma faktoru HrdB během vegetativní fáze růstu. Ukázalo se, že druhý sigma faktor, SigQ, je důležitým regulátorem metabolismu dusíku a regulátorem reakce na osmotický...
|
|
|
The role of elF3 a Rps3 in stop codon readthrough
Poncová, Kristýna ; Valášek, Leoš (vedoucí práce) ; Vopálenský, Václav (oponent) ; Krásný, Libor (oponent)
Translace představuje složitě regulovaný a vysoce provázaný proces výroby proteinů v buňce. Má několik základních fází-iniciaci, elongaci, terminaci a recyklaci ribosomů. Naše laboratoř se zabývá studiem multifaktoriálního komplexu eukaryotického iniciačního faktoru 3 (eIF3). Zajímá nás nejen odhalování jeho molekulárních rolí v průběhu translačního cyklu, ale také jeho úloha při specifických mechanismech, které se podílí na regulování translace v závislosti na buněčných potřebách. eIF3 se skládá v kvasinkách z pěti esenciálních podjednotek (a/Tif32, b/Prt1, c/Nip1, g/Tif35 a i/Tif34). V savcích je jeho složení komplexnější s 12 podjednotkami (a-i, k-m). eIF3 je klíčový hráč nejen v iniciaci translace, ale také ve fázi recyklace ribosomů a překvapivě i v translační terminaci a pročítání stop kodonu. Posledně zmiňovaný proces má velký klinický potenciál, jelikož téměř 1/3 geneticky podmíněných onemocnění je způsobena přítomností předčasného terminačního kodonu v protein kódující oblasti. Porozumění molekulárním detailům pročítání stop kodonu a translačně terminační mašinérie je důležité pro další vývoj selektivních a méně toxických léčiv vhodných k terapii. V této disertační práci jsem popsala jak protein malé ribosomální podjednotky Rps3 řídí efektivitu rozpoznávání stop kodonu. Identifikovala jsem...
|
|
|
Regulace mykobakteriální transkripce
Kafka, Vojtěch ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Dostálová, Hana (oponent)
RNA polymeráza (RNAP) je enzym katalyzující syntézu RNA řetězce a uplatňuje se jako hlavní enzym transkripce. RNAP u mykobakterií je odlišná od ostatních bakteriálních RNA polymeráz. Pro svoji funkci vyžaduje speciální transkripční faktory, jako jsou RbpA nebo CarD. Zároveň se na mykobakteriální RNA polymerázu váže malá RNA (sRNA) Ms1, která reguluje množství polymerázy v buňce. V naší laboratoři byl také objeven protein MoaB2 jako nový vazebný partner interagující s mykobakteriální A (gen sigA), podjednotkou RNAP, významnou pro rozpoznání počáteční sekvence promotoru a iniciaci transkripce. Funkce MoaB2 v regulaci transkripce a genové exprese je doposud neznámá. Prvním cílem této diplomové práce je přispět k objasnění mechanismu, jakým Ms1 reguluje množství RNAP. Výsledky ukázaly, že tato regulace je na úrovni transkripce a to na úrovni ovlivnění aktivity promotorů řídících expresi rpoB-rpoC, které kódují katalytické podjenotky RNAP. Druhým cílem této práce je charakterizovat interakce MoaB2 s proteiny transkripčního aparátu. Výsledky potvrdily interakci MoaB2 se A a k této interakci není potřebná ani RNAP ani transkripční faktory RbpA a CarD. Role N-terminální domény A pro interakci s MoaB2 nebyla prozatím potvrzena. Shrnuto, tato práce významně přispívá k našemu pochopení mykobakteriálního...
|
host ::
RSS.