|
|
Mimetika polypeptidových hormonů z rodiny insulinu
Mařík, Vojtěch ; Jiráček, Jiří (vedoucí práce) ; Zouhar, Petr (oponent)
1 Rodina lidských peptidových hormonů podobných insulinu zahrnuje insulin, insulinu podobné růs- tové faktory 1 a 2 (IGF-1 a 2), relaxiny 1-3 a polypeptidy INSL3-6. Tyto polypeptidové hormony sdílejí podobné 3D struktury se zachováním podobného motivu rozložení disulfidových můstků, a i více či menší podobnost primární sekvence. Předpokládá se, že se tyto hormony mohly vyvinout ze stejného hypotetického evolučního prekurzoru pravděpodobně již před vznikem obratlovců. Tyto hormony vy- kazují rozdílné funkce od regulace vstupu glukózy do buněk a regulace bazální energetické rovnováhy organismu, přes vývoj plodu, růst a hojení organismu až po důležité funkce v reprodukci organismů. Mimo to mohou být tyto peptidy i zapojeny do vývoje onemocnění jako je diabetes mellitus, poruchy růstu ale i rakovina. Mimetika jsou látky napodobující strukturu přirozených molekul a agonizující či antagonizující jejich biologické efekty. Jejich hlavní výhodou proti přirozeným hormonům může být jejich větší metabolická stálost, levnější výroba, snazší způsob podání do organismu, ale i pozměněná biologická aktivita. Mimetika hormonů se mohou proto uplatnit při léčbě řady onemocnění. V této re- šeršní práci se zaměříme na známá mimetika hormonů rodiny insulinu, syntetické a strukturní strategie používané při jejich přípravě a známé...
|
|
|
Molecular mechanisms in homocystinuria: spatial arrangement of human cystathionine β-synthase
Hnízda, Aleš ; Kožich, Viktor (vedoucí práce) ; Holada, Karel (oponent) ; Jiráček, Jiří (oponent)
Chybné sbalování proteinů je považováno za hlavní patogenetický mechanismus homocystinurie z deficitu cystathionin beta-synthasy (CBS). Cílem této práce bylo studium molekulových mechanismů, které vedou k chybnému sbalování mutantních forem CBS. V první části práce jsme studovali prostorové uspořádání normální lidské CBS. Pomocí diferenčního kovalentního značení povrchově dostupných aminokyselinových zbytků jsme identifikovali kontaktní plochu mezi katalytickým jádrem a regulační doménou v lidské CBS a následně jsme navrhli strukturní model plnodélkového enzymu. V další části práce jsme studovali evoluční divergenci proteinových struktur CBS. Provedli jsme fylogenetickou analýzu, která odhalila unikátní uspořádání pro CBS z třídy nematod; doménová architektura CBS z Caenorhabditis elegans byla podrobně studována experimentálně. Nakonec jsme studovali konformační vlastnosti vybraných mutantních forem lidské CBS, které měly do různé míry narušenou tvorbu tetrameru a sníženou enzymovou aktivitu. Pomocí proteolytických technik s využitím thermolysinu jsme analyzovali devět mutantních forem, které byly exprimovány v E.coli. Zjistili jsme, že rozbalení struktury je běžným jevem při chybném sbalování mutantních CBS. Důležitost rozbalení proteinů pro patogenesi deficitu CBS byla dále prokázána pomocí...
|
|
|
Studium fyziologických funkcí betain homocystein S-methyltransferasy a betain homosystein S-methyltransferasy 2
Mládková, Jana ; Jiráček, Jiří (vedoucí práce)
Betain homocystein S-methyltransferasa (BHMT) a betain homocystein S-methyltransferasa 2 (BHMT-2) jsou dva savčí cytozolické metaloenzymy. Oba tyto enzymy se účastní metabolizmu homocysteinu (Hcy), konkrétně jeho remethylace, především v jaterních a také ledvinných buňkách. BHMT přenáší methylovou skupinu z betainu na L-Hcy za vzniku L-methioninu a dimethylglycinu (DMG). BHMT-2 přenáší methylovou skupinu z S-methylmethioninu (SMM) také na L-Hcy za vzniku dvou molekul L-methioninu. Poruchy v metabolizmu Hcy mohou vést k tzv. hyperhomocysteinemii nebo homocystinurii, které mohou mít souvislost s řadou patologických stavů. BHMT je již relativně dobře prozkoumaným enzymem. Je známa její krystalová struktura, reakční mechanizmus, připravena byla řada inhibitorů tohoto enzymu, které umožnily také in vivo studie, a nedávno se po dlouhé době podařilo vyvinout Bhmt-/- myší model. Výzkum BHMT-2 je oproti tomu teprve v začátcích a fyziologické funkce BHMT-2 zůstávají stále neznámé. Důvodem je velká nestabilita BHMT-2 a také absence selektivních inhibitorů. BHMT a BHMT-2 jsou velmi podobné enzymy, které mají 73% identitu v primární sekvenci. Výsledky této dizertační práce poskytují nové informace o vlastnostech a strukturních požadavcích aktivního centra BHMT. Tyto informace byly získány pomocí třiceti nově...
|
|
|
Determination of binding constants of human insulin complexes with serotonin, dopamine, arginine, and phenol by pressure assisted partial filling affinity capillary electrophoresis
Šolínová, Veronika ; Žáková, Lenka ; Jiráček, Jiří ; Kašička, Václav
A new method, pressure assisted partial filling affinity capillary electrophoresis (PF-ACE), has been developed to study noncovalent interactions of the hexamer of human insulin (HI) with cationic ligands, such as phenolic neurotransmitters serotonin and dopamine, and amino acid arginine, or with anionic ligand phenol, in alkaline aqueous solutions. The apparent binding constants, Kb, of the HI-ligand complexes were determined from the dependence of the effective migration time changes of the above ligands on the variable zone lengths of HI dissolved in the background electrolyte and hydrodynamically introduced into the bare fused silica capillary close to the UV detector. The HI interactions with the above ligands were found to be moderately strong, with Kb values in the range 385-1314 L/mol.
|
|
|
Příprava a charakterizace nových analogů insulinu s triazolovým můstkem v C konci řetězce B
Kuntová, Vendula ; Jiráček, Jiří (vedoucí práce) ; Ryšlavá, Helena (oponent)
Insulin je peptidový hormon nezbytný k udržení stálé hladiny glukózy v krvi. V lidském těle interaguje s dvěma isoformami receptoru, IR-A a IR-B. Tyto receptory se liší především tkáňovou distribucí v organismu, přičemž IR-A má spíše funkci mitogenní, kdežto IR-B metabolickou. Cílem této práce bylo vytvořit analog insulinu, který bude selektivní k IR-B. Připravili jsme tři nové analogy insulinu s triazolovým můstkem v pozicích B26 a B29. 1,2,3-triazolová skupina byla připravena cykloadiční reakcí katalyzovanou ionty Cu(I) mezi postranními řetězci kyseliny azidopentanové (N3Pent) v pozici B26 a propargylglycinu (Prg) v pozici B29. Analogy se navzájem lišily konfigurací atomů C nepřirozených aminokyselin v polohách B26 a B29. Konkrétně jsme připravili analog 1 s D-N3PentB26 a D-PrgB29, analog 2 s D-N3PentB26 a L-PrgB29 a analog 3 s L-N3PentB26 a D-PrgB29. Nové analogy byly testovány pro vazbu vůči oběma isoformám receptoru insulin (IR-A a IR-B). Analogy 1 a 2 byly oba slabší ve vazbě než lidský insulin a nevykazovaly selektivitu pro žádnou z isoforem. Analog 3 byl 4x silnější ve vazbě na IR-B a 2x silnější ve vazbě na IR-A než lidský insulin. Avšak vazebná selektivita tohoto analogu vůči IR-B (asi 2x) byla nižší než selektivita (asi 2,6x) jeho diastereoisomeru s L-N3PentB26 a L-PrgB29 připraveného v...
|
|
|
Analogues of IGF-1 for the study of interactions of the hormone with the receptors for IGF-1 and insulin
Macháčková, Kateřina ; Jiráček, Jiří (vedoucí práce) ; Obšilová, Veronika (oponent) ; Šulc, Miroslav (oponent)
Insulin a hormony IGF jsou součástí komplexního systému tří navzájem si podobných hormonů (insulinu, IGF-1 a IGF-2) a jejich tří příbuzných receptorů (IR-A, IR-B a IGF-1R). Tento systém hraje důležitou roli v regulaci basální energetické rovnováhy organismu, v jeho růstu, vývoji, délce života, ale i ve vývoji onemocnění jako je diabetes mellitus, rakovina, akromegalie nebo Laronův nanismus. Navzdory strukturním podobnostem má každý hormon svou jedinečnou roli v organismu. Identifikace specifických strukturních motivů v insulinu, IGF-1 a IGF-2, které spouštějí specifické signalizační dráhy, by byla přínosem pro racionální návrh léčiv, pro bezpečnější léčbu diabetu, či účinnější léčbu rakoviny nebo růstových onemocnění. V této práci jsme se zaměřili na identifikaci takových strukturních motivů u hormonu IGF-1. Srovnání dat se studiemi prováděných paralelně s IGF-2 a insulinem by mohlo poskytnout komplexnější pohled na danou problematiku. Nejdříve jsme vyvinuli nezbytné metodologie pro přípravu analogů IGF-1. Vyvinuli jsme nový postup pro celkovou chemickou syntézu analogů IGF-1 založený na syntéze fragmentů IGF-1 na pevné fázi a jejich spojování pomocí cykloadice azidů a alkynů katalyzované ionty CuI . Paralelně jsme vyvinuli postup pro rekombinantní produkci IGF-1 a jeho analogů v E. coli. Abychom...
|
|
|
Studium mechanismů regulace vybraných proteinkinas
Petrvalská, Olívia ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Jiráček, Jiří (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Proteiny 14-3-3 skrze vazbu více než 300 vazebných partnerů regulují značné množství biologicky významných dějů, např. apoptosu, buněčný cyklus, přenos signálu či metabolické dráhy. V rámci této disertační práce byla studována úloha proteinů 14-3-3 v regulaci dvou vybraných proteinkinas ASK1 a CaMKK2. Hlavním cílem práce bylo pochopit strukturní podstatu mechanismů, kterými fosforylace a vazba proteinů 14-3-3 regulují aktivitu těchto proteinkinas pomocí různých biochemických a biofyzikálních metod, zejména metod bodové mutagenese, měření enzymové aktivity, analytické ultracentrifugace, maloúhlového rozptylu rentgenového záření, chemického zesítění, nukleární magnetické rezonance a fluorescenční spektroskopie. Na základě získaných dat z maloúhlového rozptylu rentgenového záření a chemického zesítění byl navrhnut model struktury komplexu katalytické domény proteinkinasy ASK1 s proteinem 14-3-3ζ, který ukazál, že tento komplex je v roztoku konformačně heterogenní. Tento strukturní model společně s daty z časově rozlišené fluorescence a nukleární magnetické rezonance částečně vysvětlují inhibiční mechanismus proteinu 14-3-3. Získané výsledky ukázaly, že protein 14-3-3ζ interaguje s katalytickou doménou ASK1 v těsné blízkosti aktivního místa, a proto by tato interakce mohla mít vliv na strukturu nebo...
|
|
|
Příprava analogů insulinu pro studium interakce s receptory insulinu.
Hanková, Kateřina ; Jiráček, Jiří (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Insulin jako jeden z důležitých hormonů lidského organismu se podílí na řadě metabolických procesů. Jednou z funkcí insulinu je pak regulace hladiny glukosy v krvi a jejího vstupu do tkání, ale i stimulace růstu buněk. Insulin má velmi podobnou primární i terciální strukturu s růstovými faktory IGF-1 a IGF-2, jejichž primární funkcí je regulace růstových procesů organismu. Zprostředkování účinku těchto tří hormonů na buněčné úrovni je zajištěno díky jejich specifickým receptorům (mitogenní isoformě receptoru insulinu IR-A, metabolické isoformě IR-B a receptoru pro IGF-1), což může, díky podobnosti těchto receptorů i hormonů, vést ke křížovým interakcím mezi nimi. Poruchy tohoto systému mohou vést k závažným onemocněním. Nejrozšířenějším z těchto nemocí je diabetes mellitus, ale závažné jsou i poruchy růstu a rakovinné bujení. Vytvoření takového analogu insulinu, který bude selektivní pouze pro isoformu IR-B receptoru insulinu, by mohlo vést zejména k bezpečnější léčbě diabetu. Tato práce se zaměřuje na lepší pochopení významu jednotlivých aminokyselin na daných pozicích v A-řetězci insulinu, u kterých je předpokládáno, že jsou součástí vazebného místa hormonu pro receptory. Tyto znalosti by mohly vést k následnému lepšímu porozumění významu těchto aminokyselin ve vazbě na receptory IR-A, IR-B a...
|
|
|
Synthesis and characterization of new insulin derivatives with altered selectivity for insulin and IGF-1 receptors.
Halamová, Tereza ; Jiráček, Jiří (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Receptor insulinu (IR) existuje ve dvou izoformách (IR-A a IR-B) lišících se tkáňovou distribucí a možná i funkcí, tzn. jejich odpovědí na vazbu insulinu. Předpokládá se, že zatímco IR-A spouští zejména mitogenní procesy vedoucí k dělení a proliferaci buněk, IR-B spouští především metabolické procesy vedoucí zejména ke vstupu molekul glukosy z krve do nitra svalových a tukových buněk. Insulin se může slaběji vázat i na receptor pro růstový faktor IGF-1 (IGF-1R), který je zodpovědný hlavně za procesy spojené s vývojem a růstem organismu. Deriváty insulinu vážící se selektivně pouze na jeden z receptorů by měly velký význam pro studium receptorů, ale potenciálně i pro léčbu nemocí jako je cukrovka nebo rakovina. V této práci jsme využili zkušeností ve studiu struktury a aktivity insulinu pro návrh, přípravu a biologickou charakterizaci 4 nových derivátů insulinu s cílem pozměnit selektivitu vůči jednotlivým receptorům. Modifikace v nových analozích spočívaly v amidaci C-konce řetězce B insulinu a postupném prodlužování tohoto řetězce o 1-3 glyciny s amidovaným C-koncem. Pro všechny nové analogy byly určeny jejich vazebné afinity vůči IR-A a IR-B a pro některé z analogů i vůči IGF-1R. Nakonec byly určeny schopnosti analogů aktivovat IR-A a IR-B, tzn. indukovat autofosforylaci vnitrobuněčných...
|
|
| |
host ::
RSS.