|
| |
|
|
Impact of the glycine-rich loop on the function of processing peptidases of the mitochondrial type
Kučera, Tomáš ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Ettrich, Rüdiger (oponent)
SOUHRN Většina mitochondriálních proteinů je syntetizována na cytosolických ribozomech ve formě svých prekurzorů nesoucích signální sekvence, které umožňují jejich transport do mitochondrií. Jakmile proteinový prekurzor dosáhne mitochondriální matrix, signální sekvence již není potřeba a je odštěpena heterodimerní mitochondriální "processing" peptidasou (MPP; α/β). Ačkoli krystalová struktura MPP je známa, mechanismus funkce MPP je stále předmětem diskusí. Volná molekulárně-dynamická (MD) simulace byla použita k detailnímu studiu strukturních znaků glycinové smyčky (GRL) regulační α-podjednotky kvasinkové MPP. Struktury divoké a mutantní formy MPP s delecí celé glycinové smyčky byly studovány i v přítomnosti substrátu v aktivním místu peptidasy. Cílená MD simulace byla použita ke studiu mechanismu translokace substrátu z GRL do aktivního místa. Prokázali jsme, že přirozená konformační flexibilita GRL je zcela zásadní pro translokaci substrátu z okolního prostředí do aktivního místa peptidasy. Ukazujeme, že α-helikální konformace substrátu je důležitá nejen během jeho prvotního kontaktu s MPP (t.j. rozpoznání substrátu), ale také později, přinejmenším během prví třetiny translokační dráhy substrátu. Dále ukazujeme, že substrát zůstává v kontaktu s GRL během celé první třetiny translokace, během níž...
|
|
|
Funkce proteinu LmbW v biosyntéze antibiotika linkomycinu
Steiningerová, Lucie ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Seydlová, Gabriela (oponent)
4-Alkyl-L-prolinové deriváty (APD) jsou specializované prekurzory, které jsou zabudovány do struktur nejméně tří skupin jinak zcela odlišných látek: některých pyrrolo-1,4- benzodiazepinů, látek s protinádorovou aktivitou, bakteriálního hormonu hormaomycinu a linkomycinu, klinicky používaného linkosamidového antibiotika. Tyto látky sdílejí biosyntetickou dráhu, která je kódovaná 5 či 6 homologními geny nalezenými v biosyntetických genových shlucích producentů těchto látek. Podobnosti biosyntézy a zároveň rozdílnosti struktur jejich APD by mohly být využity k přípravě hybridního producenta biologicky účinnějšího derivátu linkomycinu. APD prekurzorem linkomycinu je neobvyklá aminokyselina 4-propyl-L-prolin (PPL). Původní představa biosyntetické dráhy PPL není zcela v souladu s dosavadními poznatky, bylo tedy nutné ji revidovat. První dva kroky PPL dráhy jsou funkčně prokázané, prokázání následujícího kroku bylo cílem této práce. Protein LmbW byl nadprodukován a in vitro testováním byla potvrzena jeho methyltransferasová aktivita, která odpovídá jeho sekvenční analýze. LmbW je schopný methylovat přímo meziprodukt druhého kroku biosyntetické dráhy, zatímco dosavadní koncept PPL dráhy předpokládal methylaci až v pozdější fázi biosyntézy. Zajímavé je zjištění, že LmbW je schopný ke svému substrátu připojit i delší...
|
|
|
Substrátová specifita adenylačních domén synthetas v sekundárním metabolismu.
Vobruba, Šimon ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Klíčovým krokem biosyntézy linkosamidových antibiotik je kondenzace řízená oligomerním enzymem linkosamidsyntetázou (LS). Tento unikátní enzym katalyzuje spojení aminokyselinové a aminocukerné složky obou linkosamidů - linkomycinu a celesticetinu. Jednou z nejdůležitějších komponent LS je adenylační doména rozpoznávající a aktivující aminokyselinové prekurzory. Substrátová specifita adenylační domény je určena souborem 10 aminokyselinových zbytků, nazývaných neribozomální kód, jejichž postranní řetězce jsou v kontaktu se substrátem. Homologní adenylační domény LmbC z biosyntézy linkomycinu a CcbC z biosyntézy celesticetinu aktivují odlišné aminokyselinové prekurzory (2S,4R)-4-propyl-L-prolin (PPL) resp. L-prolin. V první části práce byl experimentálně otestován vliv vybraných aminokyselinových zbytků neribozomálního kódu LmbC na substrátovou specifitu celé domény. Byly určeny aminokyselinové zbytky, jejichž postranní řetězce mají největší význam pro preferenci PPL substrátu oproti L-prolinu: G308, A207 a L246. V druhé části práce byl posuzován vliv dvojitých mutací v neribozomálním kódu LmbC a CcbC na substrátovou specifitu obou domén. Byly připraveny a biochemicky charakterizovány domény LmbC G308V + A207F a CcbC V306G + F205A. Výsledky obou bloků experimentů přinesly nové důkazy pro platnost homologních...
|
|
|
Lekce z přírody - příprava hybridních bioaktivních látek
Vobruba, Šimon ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Zikánová, Blanka (oponent)
Sekundární metabolity jsou biologicky aktivní látky, produkované především mikroorganismy. Zpravidla nejsou nezbytné pro přežití produkujících mikroorganismů, nicméně ovlivňující jejich fyziologii a mikrobiální ekologii. Mnoho z nich je využíváno ve farmacii, biologii a chemii. Tato práce shrnuje poznatky o původu a směru vývoje sekundárních metabolitů. Důležitou vlastností genů kódujících sekundární metabolity je jejich organizace do shluků. Mezi popsané mechanismy modifikací genových shluků pro biosyntézu sekundárních metabolitů patří mutace genů či intragenové přestavby. Ty se v přírodě výrazně projevují v evoluci shluků, kódujících sekundární metabolity s modulárním typem syntézy. Může však také docházet k fúzi genových podshluků rozdílného původu za vzniku komplexních shluků kódujících biosyntézu hybridní látky. Tyto hybridní shluky obsahují geny pocházející ze shluků různých sekundárních metabolitů. Podobná evoluční událost pravděpodobně nastala i v případě biosyntézy dvou modelových skupin přírodních látek - linkosamidů a pyrrolobenzodiazepinů. Analogické principy využívá i genové inženýrství pro cílené modifikace biosyntetických genových shluků, za účelem konstrukce producentů účinnějších biologicky aktivních látek. V práci jsou uvedeny příklady takových úprav, a to jak u látek ze skupin...
|
|
|
Společné rysy biosyntetických drah linkomycinu, některých pyrrolo-1,4-benzodiazepinů a hormaomycinu
Steiningerová, Lucie ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Mašek, Tomáš (oponent)
Linkosamidy, pyrrolo-1,4-benzodiazepiny (PBD) i hormaomycin jsou biologicky aktivní látky odlišné svou strukturou i mechanizmem působení. Linkosamidy linkomycin a klindamycin jsou antibiotika využívaná v klinické a veterinární praxi např. v léčbě anaerobních infekcí. PBD jsou testovány pro svou protinádorovou aktivitu, hormaomycin je bakteriální hormon. Linkomycin má do své struktury začleněn neobvyklý prekurzor, 4- propyl-L-prolin (PPL), vznikající z L-tyrosinu. Hormaomycin i některé PBD (tomaymycin, anthramycin, sibiromycin) mají i přes celkovou strukturní nepodobnost s linkomycinem ve své struktuře integrován prolinový motiv s dvou- nebo tří- uhlíkatým postranním řetězcem, stejného biosyntetického původu jako PPL. V biosyntetických genových shlucích příslušných sekundárních metabolitů lze proto nalézt pět nebo šest ortologních genů kódujících biosyntézu těchto strukturně podobných prekurzorů. Existuje zřetelná evoluční souvislost biosyntézy linkomycinu, hormaomycinu a některých PBD. Není však známo, kde unikátní PPL dráha vznikla, rozvíjela se, jaké existují v přírodě její další modifikace, ani jaké byly cesty přenosu biosyntetických genů mechanizmem horizontálního genového přenosu. Odpovědi na tyto otázky jsou významné zejména z pohledu přípravy nových hybridních látek s lepšími bioaktivními účinky.
|
|
|
Příprava a charakterizace proteinu LmbX zúčastněného v biosyntéze antibiotika linkomycinu
Jiráčková, Petra ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Janderová, Blanka (oponent)
Linkomycin je antibiotikum využívané v klinické praxi. Jeho producentem je Streptomyces lincolnensis. Linkomycin se skládá z aminocukerné a aminokyselinové složky, které jsou spojeny amidovou vazbou. Aminokyselinovým prekurzorem je propylprolin (PPL), jehož biosyntéza probíhá dráhou vycházející z tyrosinu. Modifikovaná PPL dráha byla také objevena u pyrrolobenzodiazepinů (PBD) a hormaomycinu. V biosyntéze PBD je PPL prekuzor dále modifikován reakcemi katalyzovanými specifickými enzymy nepřítomnými v biosyntéze linkomycinu. Geny kódující tyto enzymy by mohly být přeneseny do genového shluku pro biosyntézu linkomycinu. Tímto způsobem bychom mohli získat producenty hybridních antibiotik s lepšími vlastnostmi, a dokonce antimalarickými účinky. PPL dráhy se účastní šest enzymů, které jsou kódovány v genovém shluku pro biosyntézu linkomycinu. První dvě reakce biosyntézy PPL byly již prokázány, proto se tato práce zaměřuje na reakci třetí, kterou by měl podle literatury katalyzovat protein LmbX. Jeho předpokládaná funkce v biosyntéze PPL je hydrolýza C-C vazby. Podle sekvenční homologie však protein LmbX patří do rodiny isomeras. V této práci byl nadprodukován protein LmbX a byla testována jeho aktivita v přítomnosti předpokládaného substrátu. Produkty byly měřeny na kapalinovém chromatografu (UHPLC)....
|
|
|
Charakterizace glycinové smyčky alfa podjednotky mitochondriální procesující peptidasy Saccharomyces cerevisiae
Chytrá, Dana ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Zikánová, Blanka (oponent)
Mitochondriální procesující peptidasa (MPP) je heterodimerní enzym patřící do M16B skupiny metaloendopeptidas. Univerzální funkce tohoto enzymu je v rozeznání a odštěpení velké škály sekvenčně i délkou odlišných presekvencí prekurzorů proteinů určených do mitochondrie. MPP se skládá z katalytické β-MPP a pravděpodobně rozpoznávací α-MPP. Nejkonzervovanější oblastí v α-MPP je tzv. glycinová smyčka (GRL - glycine-rich loop), jejíž předpokládaná funkce je v primární interakci s presekvencí prekurzoru proteinu. Fluorescenčními experimenty je možné sledovat změnu konformace GRL po navázání substrátu. V rámci této diplomové práce byly pomocí metody cílené mutageneze vytvořeny konstrukty kódující α-MPP s jediným reportérovým tryptofanovým zbytkem v pozici 289 nebo 299. Tyto formy α-MPP byly nadprodukovány v buňkách E. coli BL21(DE3)+pGroESL. Aktivity dimeru MPP obsahujícího α-MPP s jediným tryptofanovým zbytkem v reportérové pozici byly porovnány s MPP z divokého kmene S. cerevisiae. Použitým substrátem byl prekurzor kvasinkové malátdehydrogenasy s fúzovanou presekvencí (pMDH) ze tří organismů (kvasinky, myši, a melounu) lišící se svou délkou. Aktivity dimeru obsahujícího α-MPP s reportérovým tryptofanovým zbytkem v pozici 289 se pohybovaly okolo 70 %, zatímco aktivity dimeru obsahujícího α-MPP s...
|
|
|
Komparativní analýza shluků genů pro biosyntézu linkomycinu a celesticetinu.
Koběrská, Markéta ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent) ; Kormanec, Ján (oponent)
ZÁVĚRY 1. Byla určena sekvence shluku genů pro biosyntézu linkomycinu z typového kmene S. lincolnensis ATCC 25466. Jeho heterologní exprese ukázala, že shluk je kompletní a dostačuje pro produkci celé molekuly linkomycinu. Porovnání linkomycinových shluků typového kmene S. lincolnensis ATCC 25466 a nadprodukčního kmene S. lincolnensis 78-11 ukázalo řadu odlišností. 2. Identifikace a izolace genového shluku celesticetinu ze S. caelestis ATCC 15084 umožnila určení celé sekvence nesoucí genetickou informaci pro jeho biosyntézu. 3. Pro predikci funkcí jednotlivých genů linkomycinového shluku byly zvoleny dva hlavní přístupy: jednak komparativní analýza s nově charakterizovaným celesticetinovým shlukem i PBD shluky, dalším nástrojem byla inaktivace vybraných genů linkomycinového shluku a analýza jimi produkovaných látek. 3a. Komparativní analýza umožnila přiřadit funkce většině genů linkomycinového i celesticetinového shluku. Nejdůležitějším výstupem je predikce podjednotek NDLS, klíčového enzymu biosyntetické dráhy linkosamidů. Analýza v obecné rovině demonstrovala modulární uspořádání genových shluků na několika úrovních a ozřejmila pravděpodobné procesy molekulární evoluce biosyntézy linkosamidů i PBD sloučenin. 3b. Tři pravděpodobně regulační geny lmbIH, lmbQ a lmbU byly nahrazeny inaktivačními kazetami....
|
|
|
Genetická charakterizace tetracyklinové resistence u vybraných půdních isolátů bakterií.
Hucková, Tereza ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Janata, Jiří (oponent)
GENETICKÁ CHARAKTERIZACE TETRACYKLINOVÉ REZISTENCE U VYBRANÝCH PŮDNÍCH IZOLÁTŮ BAKTERIÍ Abstrakt Rezistence k antibiotikům se stále více rozšiřuje mezi bakteriálními mikroorganizmy. Abychom byli schopní na tuto situaci reagovat, je nutné podrobně porozumět všem mechanizmům rezistence a možnosti rozšiřování genů rezistence v prostředí. V této práci jsme se pokusili identifikovat determinantu rezistence k tetracyklinu u vybraných půdních izolátů grampozitivních i gramnegativních bakterií. Tyto izoláty pocházejí z půdy nehnojené a půdy, která byla hnojena mrvou kontaminovanou tetracyklinem. U izolátů jsme testovali přítomnost dvaceti třech vybraných determinant rezistence k tetracyklinu a přítomnost determinant rezistence k tetracyklinu v knihovně DNA. U izolátů rodu Staphylococcus jsme identifikovali determinantu rezistence tet(K). U izolátu rodu Arthrobacter byl amplifikován fragment DNA primery pro tet(M) determinantu, její přítomnost však nebyla potvrzena sekvenačně. U izolátů rodů Chryseobacterium a Stenotrophomonas nebyla přítomna žádná z testovaných determinant rezistence k tetracyklinu. Podařilo se však prokázat probíhající horizontální přenos genů mezi rody Stenotrophomonas a Chryseobacterium a u rodu Chryseobacterium byly identifikovány geny kódující hybridní protein a efluxní pumpu SmeW, oba...
|
host ::
RSS.