|
|
Využití průtokové cytometrie pro diagnostiku a charakterizaci dědičných poruch glykosylace
Veselá, Šárka ; Hansíková, Hana (vedoucí práce) ; Hodek, Petr (oponent)
Dědičné poruchy glykosylace (CDG) jsou vzácná multisystémová metabolická onemocnění, jejichž počet v posledních letech výrazně narůstá. Projevují se velmi širokým spektrem klinických příznaků. Ve většině případů jsou způsobeny mutací genů kódujících enzymy glykosylační dráhy. Na základě typu poruchy jsou syndromy CDG děleny do skupin: poruchy N-glykosylace nebo O-glykosylace proteinů, defekty v modifikaci proteinů pomocí GPI kotvy, defekty glykosylace lipidů a poruchy více glykosylačních drah zároveň. Cílem práce bylo najít nové biochemické analýzy vhodné pro diagnostiku a charakterizaci pacientů s CDG. Pro vybrané markery (Sambucus Nigra (SNA) lektin, proaerolysin (FLAER), protilátky proti proteinům CD55 a CD59) byly optimalizovány experimentální podmínky a značení byla následně aplikována na kultivované kožní fibroblasty kontrol a vybraných pacientů s CDG (ATP6AP1-CDG, PIGN-CDG, SLC10A7-CDG, deficit PISD) diagnostikovaných na základě celoexomového sekvenování. Experimenty byly prováděny za použití průtokové cytometrie (FACS) a fluorescenční mikroskopie (FM). Byla dosažena optimalizace detekce sializace pomocí SNA lektinu i analýzy změn mitochondriálního membránového potenciálu pomocí fluorescenčně značené sondy JC-1 se simulací defektu mitochondrií pomocí FCCP. Analýzou FACS i FM byla prokázána...
|
|
|
Biochemical and molecular studies of the congenital disorders of glycosylation
Ondrušková, Nina ; Hansíková, Hana (vedoucí práce) ; Stiborová, Marie (oponent) ; Hřebíček, Martin (oponent)
Dědičné poruchy glykosylace (Congenital disorders of glycosylation, CDG) jsou rychle rostoucí skupinou vzácných dědičných metabolických poruch s prevalencí až 1:20 000, které jsou zapříčiněny genetickými defekty narušujícími proces glykosylace, tj. enzymatického připojení specifické sacharidové struktury na kostru proteinů nebo lipidů. Kvůli nespecifitě a variabilitě klinických příznaků u pacientů je určení diagnózy CDG velmi složité, a významně se spoléhá na správnou biochemickou a genetickou analýzu. Záměrem předložené dizertační práce bylo studium CDG na biochemické a molekulárně-genetické úrovni v rámci České a Slovenské republiky, které zahrnovalo tři specifické cíle: A.) zavést a optimalizovat laboratorní screeningové metody pro detekci CDG u klinicky suspektních pacientů, B.) určit odpovídající genetický defekt u pozitivních pacientů zachycených pomocí screeningu a studovat patobiochemické aspekty jednotlivých typů CDG na buněčné úrovni, a C.) analyzovat poruchy glykosylace s jinou (non-CDG) etiologií. Mezi přínosy této práce patří optimalizace isoelektrické fokusace apolipoproteinu C-III (ApoC-III) jako metody pro detekci abnormální O-glykosylace, a také popis praktických implikací metod pro screening CDG (např. detekce specifického polymorfizmu transferinu, u kterého nelze screening CDG...
|
|
|
Mitophagy in Huntington's Disease
Šonský, Ivan ; Hansíková, Hana (vedoucí práce) ; Macůrková, Marie (oponent)
Mitochondriální dysfunkce výrazně přispívají k projevu mnoha neurodegenerativních onemocnění, jako je například Huntingtonova choroba (HD). U HD, mutace genu pro huntingtin (HTT), kde dochází k expansi CAG repetic, způsobuje nárůst polyglutaminového řetězce, který je zodpovědný za toxicitu proteinu. Obrat nefunkčních nebo jinak poškozených mitochondrií je zajištěn skrze proces selektivní autofagie, mitofagie. Poruchy mitofagie byly recentně popsány jako klíčové u řady onemocnění nejen neurodegenerativního charakteru. Vedou k postupnému hromadění nefunkčních mitochondrií, organel zodpovědných za splnění vysokých energetických nároků neuronálních buněk. Tato neurodegenerace je nejvíce výrazná u "medium spiny" neuronů striatu a vede k vývoji motorických a kognitivních poruch. Tato práce shrnuje, jak HD ovlivňuje mitofagii. Dále odhaluje, že největším blokem mitofagie je nejspíše narušené cílení mitochondrií do formujících se autofagosomů, způsobené abnormální interakcí mHTT a ubiquitin vazebného proteinu, p62. Právě indukce mitofagie v tomto kroku by mohla být zásadní pro budoucí terapeutický výzkum HD. Iniciace mitofagie obecně by se pak mohla stát relevantním terapeutickým cílem ve vývoji léčby dalších neurodegenerativních onemocnění. Klíčová slova: mitofagie, autofagie, PINK1, neurodegenerativní...
|
|
|
Mitochondriální pór přechodné propustnosti
Sereghy, Ursula ; Hansíková, Hana (vedoucí práce) ; Čapková, Markéta (oponent)
Mitochondriální pór přechodné propustnosti (mPTP) je vysoce evolučně konzervovaný kanál nacházející se ve vnitřní membráně mitochondrie. Tento pór je neselektivně propustný pro molekuly o hmotnosti menší než 1,5 kD. Otevření póru v důsledku např. zvýšené koncentrace Ca2+ nebo reaktivních forem kyslíku (ROS) a následná depolarizace membrány může vést k narušení protonového gradientu, snížení produkce ATP a následně i k buněčné smrti. Smrt buňky v důsledku otevření mPTP je patofyziologickým jevem, který provází např. ischemická onemocnění a neurodegenerativní poruchy, jako je Alzheimerova nemoc nebo Huntingtonova choroba. Studium složek a funkce mitochondriálního póru přechodné propustnosti je významné pro výzkum mechanismu onemocnění, které vede k vývoji vhodných farmaceutik a snížení mortality a morbidity pacientů. Tato práce shrnuje vývoj výzkumu struktury a funkce kanálu za fyziologických a vybraných patologických podmínek a stručně popisuje některé experimentální metody.
|
|
|
Studium vybraných aspektů modifikace proteinů pomocí β-N-acetylglukosaminu
Bittenglová, Kateřina ; Hansíková, Hana (vedoucí práce) ; Kohoutová, Michaela (oponent)
O-glykosylace pomocí β-N-acetylglukosaminu (O-GlcNAc) je posttranslační modifikace proteinů, regulovaná β-N-acetylglukosaminyltransferasou (OGT) a β-N-acetylglukosaminidasou (OGA). Tato intracelulární glykosylace se podstatně liší od ostatních typů, je dynamicky regulována podobně jako fosforylace, β-N-acetylglukosamin hraje roli výživového a stresového senzoru v buňce. Chronicky dysregulovaná O-GlcNAcylace je spojována s patogenezí řady chorob, jako je např. diabetes mellitus II. typu, onkologická a neurodegenerativní onemocnění. Exprese enzymů OGT i OGA je velmi citlivá na změny v homeostáze GlcNAc, který je syntetizován z glukosy prostřednictvím hexosaminové biosyntetické dráhy. Změny v expresi enzymů OGT a OGA by mohly být využity jako potenciální krevní markery např. pro časný diabetes. Cílem diplomové práce bylo studovat změny v expresi genů kódujících enzymy OGT i OGA v souboru pacientů s obezitou ve srovnání s kontrolami a porovnat stav před a po úpravě životního stylu (redukci váhy). Analyzovaný soubor tvořilo 34 vzorků izolovaných lymfocytů z periferní krve od obézních dospívajících a 80 vzorků od dospělých pacientů. RNA byla izolována pomocí TriReagentu, kvantifikace exprese mRNA byla provedena metodou qPCR. Analýza dat v souboru obézních dospívajících pacientů neprokázala signifikantní...
|
|
|
Analýza obsahu dolicholu v moči u pacientů s dědičnými poruchami glykosylace pomocí hmotnostní spektrometrie
Zdražilová, Lucie ; Hansíková, Hana (vedoucí práce) ; Kohoutová, Michaela (oponent)
Dolichol je membránový lipid, který se podílí na glykosylaci proteinů a biosyntéze glykosylfosfatidylinositolové kotvy. Jeho struktura je složená z isoprenových jednotek a je přítomen ve všech tkáních a většině membránových organel eukaryotických buněk. Nedávno byly některé typy dědičných poruch glykosylace popsány jako důsledek poruchy biosyntézy a metabolismu dolicholu, které však nejsou zachytitelné běžnými metodami. Cílem bylo zavést analýzu obsahu dolicholu v moči a tkáních pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie, analyzovat obsah dolicholu v souboru pacientů s vybranými typy dědičných poruch glykosylace a studovat dopad poruchy biosyntézy dolicholu na energetický metabolismus. Biologický materiál pro analýzu obsahu dolicholu tvořil kontrolní soubor močí od 76 zdravých kontrol ve věku od 1 měsíce do 81 let, 6 pacientů s dědičnými poruchami glykosylace, 43 pacientů s podezřením na toto onemocnění; a vzorky tkání: frontálního kortexu, jater, kosterního svalu a srdce od dvou pacientů s poruchou v genu NUS1 a kontrol. Pro funkční studie energetického metabolismu byly použity linie kultivovaných kožních fibroblastů. Lipidová složka byla po extrakci separována na kapalinovém chromatografu a dolicholy byly analyzovány na tandemovém hmotnostním spektrometru. Byly detekovány dolicholy se 17-20...
|
|
|
Following the phenotype development of TgHD minipigs by invasive and noninvasive approach
Ellederová, Zdeňka ; Baxa, Monika ; Vidinská, Daniela ; Bohuslavová, Božena ; Vochozková, Petra ; Šmatlíková, Petra ; Klíma, Jiří ; Valeková, Ivona ; Ardan, Taras ; Juhás, Štefan ; Juhásová, Jana ; Konvalinková, R. ; Klempíř, J. ; Pokorný, M. ; Krupička, R. ; Kauler, J. ; Hansíková, H. ; Motlík, Jan
Recent promising treatments for Huntington’s disease (HD) may require pre-clinical testing in large animals. In 2009, we generated HD transgenic (TgHD) minipigs with one copy encoding the N-terminal part (548 aa) of human huntingtin (HTT) with 124 CAG/CAA repeats integrated into chromosome 1 q24-q25. The successful germ line transmission occurred through four successive generations.
|
|
|
Mitochondrial phenotype in minipig model transgenic for N-terminal part of human mutated huntingtin
Hansíková, H. ; Rodinová, M. ; Křížová, J. ; Dosoudilová, Z. ; Štufková, H. ; Bohuslavová, Božena ; Klíma, Jiří ; Juhás, Štefan ; Ellederová, Zdeňka ; Motlík, Jan ; Zeman, J.
Huntington’s disease (HD) is neurodegenerative disorder caused by an abnormal expansion of CAG repeat encoding a polyglutamine tract of huntingtin (htt). It has been postulated that mitochondria dysfunction may play significant role in the pathophysiology of the HD. But it is still not known yet in detail how mitochondria are able to cover energy needs of the cells during the progression of the HD.
|
|
| |
|
|
Úloha mitochondrií v patogenezi Huntingtonovy nemoci
Řeháková, Kateřina ; Hansíková, Hana (vedoucí práce) ; Kohoutová, Michaela (oponent)
Huntingtonova nemoc (HD) je neurodegenerativní onemocnění postihující nervový systém. Je způsobená mutací genu kódující protein huntingtin. Mutace se projevuje znásobením tripletů CAG. Huntingtin je přítomný především v cytoplazmě. Interaguje s mnoha proteiny a role svou roli také při transkripci a buněčném transportu. Dále se také účastní správné regulace embryonálního vývoje a vývoje nervové tkáně. Je známo, že mutovaný huntingtin způsobuje vznik oxidačního stresu, poruchy biogeneze mitochondrií a poruchy OXPHOS. Diagnostika Huntingtonovy nemoci je založena na laboratorním vyšetření přítomnosti alely predisponující ke vzniku nemoci. Klinický obraz je také důležitou součástí diagnostiky. Pacient vykazuje neovladatelné choreatické pohyby těla a různě rozsáhlé demence. Cílem bakalářské práce bylo v teoretické části popsat hlavní charakteristiky Huntingtonovy nemoci se zaměřením dopadu HD na mitochondriální energetický metabolismus. V praktické části bylo cílem analyzovat respiraci mitochondrií pomocí vysoce citlivé polarografie v souboru 3 linií fibroblastů od pacientů s HD. Polarografická analýza ukázala, že respirace fibroblastů od pacientů s HD byla snížená ve srovnání s kontrolními liniemi. V naší studii se HD nejvíce projevila poškozením komplexu II oxidační fosforylace. Klíčová slova:...
|
host ::
RSS.