|
|
Proteiny jako zdroj dusíku pro rostliny tabáku pěstované in vitro
Bělonožníková, Kateřina ; Ryšlavá, Helena (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent)
Dusík (N) patří mezi nepostradatelné prvky pro růst a vývoj rostlin. Dříve byla pozornost soustředěna hlavně na jeho anorganické formy - dusičnany a amonné kationty. V půdě je N přítomen také v organické formě, kterou představují i proteiny, o které mohou rostliny soutěžit s půdními mikroorganismy. V současné době jsou zvažovány dva mechanismy - hydrolýza proteinů sekretovanými proteasami a endocytóza nativních proteinů, případně jejich souhra. Rostliny tabáku byly pěstovány in vitro za sterilních podmínek v modifikovaném Murashige- Skoogově médiu s kaseinem jako jediným zdrojem N (KAS), se sníženou koncentrací anorganických forem N (AD) nebo v kompletním Murashige-Skoogově médiu jako kontrolní rostliny (MS). Po 12 týdnech růstu byly změřeny standardní růstové parametry rostlin. KAS rostliny byly schopné růst bez přítomnosti anorganické formy N, a obsah proteinů v listech byl vyšší než v ostatních experimentálních rostlinách. Proteomická analýza ukázala rozdíly v expresi proteinů v kořenech rostlin v závislosti na formě N v kultivačním médiu. Celkově bylo identifikováno 185 proteinů, z nichž 75 % procent proteinů bylo méně a 14 % více abundantních v KAS rostlinách. Příjem konjugátu kaseinu s fluoresceinem rostlinami a jejich proteolytická aktivita byla analyzována konfokální mikroskopií. Mezi...
|
|
|
Konformační stavy receptorů pro opioidy
Provazníková, Adéla ; Hudeček, Jiří (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent)
Tato bakalářská práce je přehledem literatury týkající se vztahu mezi strukturou a funkcí opiátových receptorů. Hlubší poznání tohoto vztahu by přispělo k porozumění funkčního mechanismu těchto membránových proteinů a k pochopení účinku opioidních látek. První část práce je zaměřena na metody získávání strukturních dat o membránových proteinech. Zvláštní důraz je kladen na krystalizaci membránových proteinů z mesofase (také označovanou jako krystalizace in meso). Následuje podrobnější rozbor krystalových struktur tří typů opioidních receptorů od celkové architektury receptoru až po detaily kontaktu molekuly ligandu s vazebnou kapsou, které jsou vizualizovány pomocí programu PyMol. Stejný přístup byl využit také pro hledání korelace mezi staršími daty o vlivu mutací některých aminokyselin na přechodu receptoru do aktivní konformace (Décaillot F.M. et al, Nature Structural Biology 10, 629, 2003) a nedávno publikovanými výsledky rentgenostrukturní analýzy. Rozbor struktury ukazuje na pravděpodobný význam interakce aspartátu v poloze 128 s tyrosinem v poloze 308 pro aktivaci opiátového receptoru.
|
|
|
Působení kyseliny valproové a její účinek v kombinaci s cytostatiky na nádorové buňky in- vitro
Hinďoš Hřebačková, Jana ; Dyr, Jan (vedoucí práce) ; Vávrová, Jiřina (oponent) ; Entlicher, Gustav (oponent)
Nádorová onemocnění představují v dnešní společnosti jeden z nejzávažnějších problémů moderní medicíny. Jejich zvyšující se incidence a velká variabilita nádorových buněk jsou hlavními důvody pro zlepšování diagnostických a terapeutických postupů. Perspektivní skupinou látek zesilujících účinky konvenční chemoterapie jsou inhibitory histondeacetylas, které lze zařadit mezi epigenetická chemoterapeutika. Nejdéle používanou látkou z této skupiny je antiepileptikum kyselina valproová, která má navíc protinádorové účinky a podporuje působení řady chemoterapeutik. Významným se jeví zejména její účinek na růst a buněčnou smrt nádorových buněk za hypoxických podmínek (<1% O2). Tato práce je zaměřena na sledování účinků kyseliny valproové na neuroblastomové buněčné linie in vitro v normoxii a hypoxii. V hypoxii vykazovala významně vyšší účinek než v normoxii. Spouštěcím mechanismem apoptotické buněčné smrti je narušení rovnovážného stavu pro- a anti apoptotických proteinů. Vnitřní apoptotická dráha je pravděpodobně zahájena narušením mitochondriální membrány 19kDa variantou proapoptotického proteinu Bax. V dalších experimentech jsme testovali účinek kombinace kyseliny valproové a DNA- poškozujících chemoterapeutik - cisplatiny a ellipticinu - na neuroblastomové buňky. Kombinace s cisplatinou vykazovala...
|
|
|
Teoretická studie enzymů spojených s procesem karcinogeneze: DNA polymerázy β a cytochromů P450
Jeřábek, Petr ; Martínek, Václav (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Ettrich, Rüdiger (oponent)
Disertační práce přispěla k poznání funkce dvou typů enzymů participujících na procesech karcinogeneze, DNA polymerázy (pol ) a cytochromů P450 (CYP). Pol je součástí opravného systému DNA "Base Excision Repair" (BER), kde tento enzym provádí vkládání nového nukleotidu do řetězce DNA na základě párování s bází templátového řetězce. Mutované formy pol byly nalezeny v 30% lidských tumorů, což ukazuje na její důležitou úlohu v procesu karcinogeneze. V disertační práci byly studována schopnost pol rozlišovat mezi "správnou" a "špatnou" bází v průběhu jejího vkládání do DNA, tzv. "fidelitu" (přesnost přiřazení "správného" nukleotidu, v duchu pravidel komplementarity). K tomu byly využity metody počítačového modelování, vhodné pro porovnání energetických rozdílů mezi komplexy obsahující "správnou" a "špatnou" bází. Použita byla metoda výpočtu volných energií LRA. Výsledky signalizují, že jeden z hlavních příspěvků k celkové "fidelitě" pol spočívá v lepší stabilizaci tranzitního stavu nukleofilní substituce "správné" báze, oproti "špatné". Tento rozdíl přispívá 80-ti násobkem k celkové "fidelitě"¨ tohoto enzymu. Identifikovány byly i strukturní prvky, které jsou důležité pro "fidelitu" pol i katalýzu tohoto enzymu. Pro studium sledující vliv mutací na "fidelitu" pol byly použity metody FEP...
|
|
|
Studium fluorescenčních produktů v mitochondriích po napadení volnými radikály
Ivica, Joško ; Wilhelm, Jiří (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Drahota, Zdeněk (oponent)
Lipofuscinoidní pigmenty (LFP) jsou produkty reakcí, ve kterých volné radikály napadají molekuly s nukleofilními skupinami. LFP vznikají např. v reakcích mezi produkty rozkládaní peroxidů lipidů, což jsou hlavně reaktivní aldehydy, a sloučeninami obsahujícími aminoskupiny (fosfolipidy, peptidy). LFP lze snadno měřit díky jejich vnitřní fluorescenci. Tyto produkty jsou poměrně stabilní, a proto byly úspěšně využívány jako robustní markery oxidačního poškození. Provedli jsme metabolomické studie, přičemž LFP byly nejprve analyzovány fluorimetricky pomocí trojrozměrných a diferenciálních fluorescenčních spekter. Potom jsme LFP analyzovali pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie s cílem rozdělit směs látek na jednotlivé frakce. LFP jsme získali z izolovaných mitochondrií vystavených in vitrooxidačnímu stresu zahájenému různými spouštěči. LFP byly rovněž analyzovány v potkaních mozcích během časného rozvoje, což je doprovázeno přechodným zvýšením koncentrace kyslíku, a v erytrocytech z pacientů s Alzheimerovou chorobou. Vyvinuli jsme HPLC metodu pro kvalitativní analýzu LFP odlišného původu. Tato analýza objevila, že se LFP opravdu skládají z mnoha chromatograficky odlišných látek. Tímto způsobem jsme potvrdili jsoucnost velkého počtu jednotlivých fluorescenčních látek, jež se účastní patofyziologie...
|
|
|
Biochemické změny při stárnutí červeného vína
Vacková, Tereza ; Hudeček, Jiří (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent)
Flavonoidy jsou rostlinné sekundární metabolity, které se dělí do několika skupin podle chemické struktury. Důležitými složkami vína, které jsou zodpovědné za jeho barvu, chuť a další senzorické vlastnosti, jsou barevné pigmenty - anthokyany a taniny (třísloviny). Koncentrace anthokyanů ve víně je ovlivněna odrůdou, zpracováním hroznů a klimatickými podmínkami. Ke studiu změny barvy a tím i souvisejícího chemického složení, byly použity tři nekomerční vzorky červeného vína, Svatovavřinecké, ročník 2010 a 2012, a domácí víno bez přidaného SO2. Ke stanovení barevných změn byly použity převážně kolorimetrické (metoda CieLab) a zjednodušené spektrofotometrické metody (barevná hustota a odstín). Množství anthokyanů bylo sledováno analytickou metodou RP-HPLC. Koncentrace fenolických látek byla stanovena upravenými enologickými metodami. Během stárnutí vína došlo k barevným změnám, které byly způsobeny polymerizačními reakcemi, které probíhají mezi anthokyany a fenolickými sloučeninami. To vedlo ke vzniku stabilních barevných pigmentů, které se projevily vyšším absorpčním maximem a tedy i tmavším zabarvením. Klíčová slova: anthokyany, barva, červené víno, fenolické sloučeniny, malvidin-3-glukosid, polymerizační reakce, pigmenty.
|
|
|
Metabolismus karcinogenů a léčiv monooxygenasovým systémem
Moserová, Michaela ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Čeřovská, Noemi (oponent)
Ellipticin, alkaloid z rostlin čeledi Apocynaceae, vykazuje významný protinádorový a anti-HIV účinek. Je pro-léčivem, jehož farmakologická účinnost a vedlejší genotoxické účinky závisí na metabolické aktivaci cytochromy P450 (CYP) a peroxidasami (Px). Z toho důvodu bylo cílem disertační práce poznání příspěvku jednotlivých CYP a Px k oxidaci ellipticinu v různých tkáních (játra, plíce a ledviny) laboratorního potkana, který byl vybrán jako vhodný model ilustrující osud ellipticinu v lidském organismu. Dále byly využity mikrosomální systémy myší s "deletovanou" reduktasou v játrech (HRNTM ) a myší kotrolní linie (WT) a purifikované enzymy CYP1A1 a 3A4. Sledován byl i vliv cytochromu b5 na produkci jednotlivých metabolitů (aktivačních a detoxikačních) ellipticinu a tvorba aduktů aktivovaného ellipticinu s DNA. Karcinogenní benzo[a]pyren (BaP) je po své aktivaci cytochromy P450 (CYPs) schopný kovalentní vazby na DNA. Sledovali jsme jeho schopnost tvorby aduktů s DNA a indukce enzymů CYP a NADPH:CYP reduktasy (RED) v myších játrech, hlavním orgánu tvorby aduktů BaP s DNA. CYP1A1 je označován za nejdůležitější enzym v metabolické aktivaci BaP. V práci jsme sledovali vliv jednotlivých složek systému monooxygenas se smíšenou funkcí (MFO systému) na metabolismus BaP. V disertační práce byly využity mikrosomální...
|
|
|
Biotransformace fenolických látek enzymovými systémy kvasinky Candida tropicalis a bakterie Comamonas testosteroni
Vilímková, Lenka ; Stiborová, Marie (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Mareš, Jaroslav (oponent)
Kvasinka Candida tropicalis a bakterie Comamonas testosteroni se vyznačují schopností využívat fenol jako jediný zdroj uhlíku a energie. V naší laboratoři se zabýváme zejména studiem cytoplasmatických enzymů zodpovědných za první a druhý krok odbourání fenolu: NADPH-dependentní fenolhydroxylasy C. tropicalis i C. testosteroni a katechol 1,2- dioxygenasy C. tropicalis. Cílem naší práce je izolovat a částečně charakterizovat tyto enzymy. Fenolhydroxylasa C. tropicalis byla purifikována použitím následující kombinace metod: chromatografie a rechromatografie cytosolárních proteinů na DEAE Sepharose, frakční precipitace polyethylenglykolem 6000 a gelové permeační chromatografie na Sephacrylu S-300. Extracelulární fenolhydroxylasa C. testosteroni byla získána frakční precipitací kultivačního média polyethylenglykolem 6000 a gelovou permeační chromatografií na 4B Sepharose a Sephacrylu S-300. Katecholdioxygenasa byla z cytosolu C. tropicalis izolována za použití metod: chromatografie a rechromatografie cytosolárních proteinů na DEAE Sepharose, lyofilizace enzymového preparátu a gelové permeační chromatografie na Sephadexu G-100 Enzymová aktivita byla měřena buď pomocí HPLC nebo spektrofotometricky. Čistota enzymů byla sledována elektroforézou SDS-PAGE. Molekulová hmotnost enzymů byla určena pomocí...
|
|
|
Připrava slepičích protilátek proti fosfoserinovym zbytkům fosfoproteinu
Benýšek, Jakub ; Tichá, Marie (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent)
Byl připraven nový typ imunogenu pro přípravu slepičích protilátek specifických pro O-fosforylované aminokyselinové zbytky fosfoproteinů: směs fosfopeptidů α-kaseinu imobilizovaná na maleylovaný derivát hovězího serového albuminu. Pro separaci fosfopeptidů α-kaseinu ze směsi peptidů po štěpení proteinu trypsinem byla použita afinitní chromatografie na imobilizovaných železitých iontech (Fe(III)-IDA-Sepharosa). Separovaná frakce fosfopeptidů α-kaseinu byla navázána na maleylovaný derivát hovězího seérového albuminu. Přítomnost navázaných fosfopeptidů byla prokázána pomocí MALDI-TOF MS analýzy. Po imunizaci slepic připraveným imunogenem, byla ze žloutků izolována imunoglobulinová frakce, která dále byla purifikována pomocí afinitní chromatografie na α-kasein-Sepharose a na hovězím sérovém albuminu imobilizovaném na Sepharose (BSA-Sepharosa). Specifita získaných protilátek byla testována pomocí ELISA testů. Bylo zjištěno, že připravené slepičí protilátky, ani jejich frakce po afinitní chromatografii na α-kasein-Sepharose O-fosforyl-O- serinový zbytek v modelových fosfoproteinech (α-kasein, fosvitin, ovalbumin) nerozpoznávají. Pomocí synteticky připravených antigenů bylo prokázáno, že slepičí protilátky připravené imunizací antigenem vázaným na maleylovaný nosný protein rozpoznávají přítomnost...
|
|
|
Eukaryotic and prokaryotic nitric oxide synthase - structure-function studies
Mikula, Ivan ; Martásek, Pavel (vedoucí práce) ; Entlicher, Gustav (oponent) ; Král, Vladimír (oponent)
Oxid dusnatý (NO) patří mezi nejdůležitější signální molekuly organismů, kde hraje zásadní roli v širokém spektru fyziologických a patologických procesů, včetně vazodilatace, přenosu nervového signálu a imunitní odpovědi organismu. Tato plynná molekula je produktem oxidační reakce katalyzované rodinou syntáz oxidu dusnatého (NOS).U savců byly identifikovány tři izoformy NOS, endoteliální (eNOS), neuronální (nNOS) a inducibilní, nebo také imunologická (iNOS). Některé bakterie nesou geny kódující proteiny homologní s oxygenázovou doménou savčích NOS a vykazující NO-syntázovou aktivitu in vitro. Předpokládá se, že NO tvořený patogenními organismy jako je B. anthracis nebo S. aureus by mohl hrát kritickou roli v patofyziologickém průběhu infekce. Komparativní studie bakteriálních "NOS-like" enzymů a savčích NOS prokázala jejich základní podobnost a zároveň rozdíly mezi jednotlivými bakteriálními proteiny i savčími izoformami při interakcích s různými analogy substrátu L-argininu a dalšími ligandy. Na základě výsledků měření kinetiky zpětné vazby NO byla predikována přítomnost druhého NO-vazebného místa v aktivním centru některých NOS. Dále byla popsána regulace dynamiky a uvolňování NO z proteinu NOS pomocí sítě vodíkových vazeb mezi hemovou prostetickou skupinou, substrátem a kofaktorem BH4. Nitrity (NO2 -)...
|
host ::
RSS.