|
|
Studies on structure and biological functions of NKR-P1 receptors
Rozbeský, Daniel ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Konvalinka, Jan (oponent) ; Drbal, Karel (oponent)
Významnou součástí imunitního systému jsou NK buňky, které jsou schopny rozpoznávat a zabíjet některé nádorové a virem infikované buňky. Rozpoznávání abnormálních buněk je zprostředkováno sofistikovaným repertoárem aktivačních a inhibičních receptorů, které se nachází na povrchu NK buněk. Mezi nejznámější receptory patří rodina C-lektinových receptorů NKR-P1, o kterých se předpokládá, že jsou transmembránové proteiny II. typu vyskytující se na membráně v podobě disulfidicky vázaných homodimerů. Ačkoliv od jejich objevu uplynulo více než 20 let, jejich struktura a funkce je stále zahalená rouškou tajemství. Cílem disertační práce byl strukturní výzkum myších NKR-P1 receptorů za účelem poznat jejich funkce. V první části jsme vyvinuli metodu pro přípravu rekombinantních receptorů myší rodiny NKR-P1. Dále jsme se detailně zabývali receptorem NKR-P1A, jehož struktura byla vyřešena pomocí rentgenové strukturní analýzy s rozlišením 1,7 A. Unikátní vlastností struktury byla smyčka extendovaná z konzervované C-lektinové domény, která v krystalu interagovala se symetricky sdruženou molekulou. Konformace a flexibilita smyčky byla dále studována v roztoku pomocí vodík/deuteriové výměny a chemického síťování ve spojení s hmotnostní spektrometrií. Jednotlivé analýzy potvrdily, že struktura NKR-P1A se v roztoku liší od...
|
|
|
Derivation and characterization of tumor cell lines labeled with fluorescent proteins
Majerová, Miriam ; Šmahel, Michal (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
Efektívnej liečbe nádorových ochorení bránia mechanizmy nádorových buniek, ktorými nádorové bunky unikajú pred imunitným systémom. Jedným z takých mechanizmov je zníženie expresie MHC I nádorovými bunkami. Výsledkom je znemožnenie eliminácie nádorových buniek CD8+ T lymfocytmi. Bunky sa pritom často vyznačujú rôznou expresiou MHC I, čo vedie k heterogenite nádorového prostredia. Táto práca sa zaoberá vytvorením modelu heterogenity expresie MHC I v nádoroch. Boli vytvorené expresné plazmidy nesúce gény pre FP a týmito plazmidmi sa označili nádorové bunkové línie TC-1, TC-1/A9 a TC- 1/dB2m s rôznou expresiou molekúl MHC I. Pri sledovaní stability expresie FP týmito líniami bolo pozorované jej klesanie v prostredí in vitro aj in vivo. V nádore zo zmesi bunkových línií TC-1+TC-1/dB2m bolo na základe expresie β2m možné rozlíšiť bunky pochádzajúce z týchto dvoch línií, ale v zmesi línií TC-1/A9+TC-1/dB2m to možné nebolo kvôli heterogenite expresie MHC I bunkami z línie TC-1/A9. Použitie kombinovanej imunoterapie malo najväčší vplyv na infiltráciu imunitných buniek v nádoroch z buniek vzniknutých z mixu línií TC-1+ TC-1/dB2m, a najviac ovplyvnenými subpopuláciami imunitných buniek boli γδ a CD8+ T lymfocyty. Imunohistochemická analýza rezov nádorov z mixu línií TC-1+TC-1/dB2m ukázala tvorbu ostrovčekov z...
|
|
| |
|
|
Komparativní genomická předpověď nových transmembránových adaptorových proteinů a jejich expresní analýza.
Pitule, Pavel ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Novotný, Marian (oponent)
Transmembránové adaptorové proteiny (TRAP) jsou důležitou složkou signálních drah vedoucích od imunoreceptorů směrem k efektorovým mechanizmům uvnitř buňky. Přestože nemají vlastní enzymatickou aktivitu, obsahují interakční motivy, kterými organizují další proteiny v čase a prostoru a iniciují efektivní tvorbu signalizačních komplexů. Funkčně nejvýznamnější TRAP jsou ty, které přímo tvoří s receptory nekovalentní komplexy a poskytují svoje intracelulární vazebné motivy, včetně tyrosinového aktivačního motivu (ITAM). Jejich deficit má výrazné dopady na přenos signálu a knockout myši vykazují zřetelný fenotyp. Podobně tomu je i u prvního objeveného TRAP, který není konstitutivně asociovaný s receptory - proteinu LAT. Obsahuje jiné typy motivů, rovněž založené na fosforylovatelném tyrosinu. Podobné strukturální vlastnosti jako protein LAT má v současnosti dalších sedm popsaných proteinů, řazených mezi TRAP. Ani jeden z nich ovšem nevykazuje výrazný fenotyp u deficitních myší. Cílem mojí diplomové práce bylo bioinformaticky prohledat proteinové databáze a identifikovat co nejvíce proteinů, které by svými charakteristikami odpovídali TRAP. Z dosavadních výsledků vyplývá, že skupina TRAP již byla téměř kompletně popsána - v genomu jsme kromě známých TRAP objevili jen málo dalších proteinů, které přesně...
|
|
|
Vliv chemoterapie a genotoxického stresu na imunologické vlastnosti nádorových buněk.
Horňáková, Michaela ; Reiniš, Milan (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
Léčba rakoviny stále zahrnuje užívání chemoterapeutických agens, které mají různé účinky na rakovinné buňky. K těmto patří například přímá toxicita k rakovinným buňkám, indukce imunologické smrti a změny ve fenotypu rakovinných buněk. V posledním desetiletí se mnoho výzkumných týmu zabývalo indukcí genotoxického stresu a buněčné senescence, kterou chemoterapie může navodit. Přestože vyvolání senescence v rakovinných buňkách je důležitým mechanismem pro potlačení nádorů, je neustále poskytováno více a více důkazů, že indukce senescence chemoterapií není vždy pro pacienty výhodná. Senescentní buňky jsou spojeny se specifickým sekrečním fenotypem, který jim umožňuje měnit jejich mikroprostředí, ovlivňovat protinádorovou imunitu, vyvolat potlačení nádorů a dokonce podporovat růst nádorů. Díky tomu eliminace senescentních buněk vrozenou či specifickou imunitou, což lze umocnit imunoterapií, může být důležitou překážkou pro růst nádorů. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Terapeutické využití alternativních vazebných proteinů cílící nádorové biomarkery v klinickém testování onkologických pacientů
Tauš, Petr ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Lepšík, Martin (oponent)
Téměř až do konce minulého století byly protilátky (imunoglobuliny) považovány za jediné vazebné proteiny schopné specifické vazby. Objev hybridomové technologie v roce 1975 umožnil vytváření monoklonálních protilátek, které po dvaceti letech vstoupily do klinické praxe. V této době byly objeveny první neimunoglobulinové proteinové struktury vhodné pro vytvoření specifického vazebného místa. Do dnešní doby bylo popsáno mnoho odlišných struktur, ale pouze několik z nich je dále vyvíjeno jako diagnostika, terapeutika nebo jako nástroje ve výzkumu. Tyto struktury nejsou zatíženy nedostatky imunoglobulinů, jako je velikost, drahá výroba a obtížný racionální návrh, a proto mají potenciál nahradit a překonat současné využití protilátek. V této bakalářské práci jsou shrnuty veškeré struktury, které jsou ve vývoji a jsou popsány zástupci v klinickém testování v oblasti nádorových terapeutik v porovnání s některými schválenými imunoglobulinovými bioléčivy.
|
|
|
FcεRI and Kit signal to actin cytoskeleton via different pathways
Šimíček, Michal ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
Žírné buňky jsou klíčovými hráči na poli vrozené imunity. V minulosti byly tyto buňky zmiňovány zejména jako iniciátory alergických a zánětlivých reakcí. Současné poznatky ovšem naznačují jejich významnou roli též v boji proti bakteriím a virům. Nyní se navíc ukazuje unikátní postavení žírných buněk v regulaci adaptivní složky imunity. Z těchto důvodů je velmi důležité důkladné pochopení signálních dějů vedoucích k diferenciaci, lokalizaci a aktivaci žírných buněk. Poznání může ve výsledku vést k vývoji nových terapeutických přístupů. Stimulace povrchových receptorů žírných buněk, FcεRI a Kit, vede k fosforylaci transmembránového adaptorového proteinu NTAL a mimo jiné k rozprostírání žírných buněk na extracelulární matrix. Morfologické studie žírných buněk postrádajících protein NTAL odhalily výrazně snížené rozprostírání těchto buněk na fibronektinu po stimulaci Ag a kombinací Ag a SCF. Následná kvantifikace plochy pokryté buňkou a dalších morfologických parametrů potvrdila předchozí pozorování. Tento fenomén byl doprovázen poruchami v polymeraci actinu. Po blokaci integrínů specifickými protilátkami nebyly pozorovány poruchy v adhezi buněk bez exprese proteinu NTAL po aktivaci Ag nebo SCF. Pozorované defekty v buněčném rozprostírání tak byly pravděpodobně z důvodu pozměněné signalizace k...
|
|
|
Studium interakce lektinových receptorů přirozených zabíječů s jejich proteinovými ligandy.
Hernychová, Lucie ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
NK buňky jsou přirozené lymfocyty, které tvoří díky svému receptorovému systému první linii obrany organismu před infekcemi. Jsou důležitou součástí protivirové, ale také protinádorové imunity, hrají roli v transplantační imunitě, autoimunitě nebo reprodukci. Tato diplomová práce se zabývá studiem struktury membránového receptoru NKR-P1B myších NK buněk a jeho interakcí s ligandem Clr-b. Cílem bylo připravit expresní vektor kódující ligand-vazebnou a celou extracelulární část receptoru NKR-P1B a optimalizovat jeho produkci a renaturaci in vitro. Připravené proteiny byly analyzovány gelovou filtrací, elektroforeticky a hmotnostní spektrometrií. Poté byla sledována jejich interakce s proteinem Clr-b biofyzikálními (gelová filtrace a povrchová plazmonová rezonance) a biologickými metodami (značení buněčných preparátů proteiny NKR-P1B s navázanou fluorescenční sondou). In vitro vazebné pokusy nepotvrdily vzájemnou intarakci NKR-P1B a Clr-b, přestože se připravené proteiny vázaly na buňky z kostní dřeně.
|
|
|
Analýza kandidátních transmembránových adaptorových proteinů
Šulcová, Jitka ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Transmembránové adaptorové proteiny (TRAP) fungují jako kotvící místa pro různé signalizační molekuly a umožňují tak vznik velkých signalizačních komplexů v blízkosti plasmatické membrány. Časově a prostorově regulují signalizační události, a tím napomáhají rychlému a efektivnímu přenosu signálu z receptorů na povrchu buněk do buněčného nitra. Důležitá role známých TRAP v závislosti na jejich lokalizaci v lipidových raftech pro správný vývoj a funkci buněk imunitního systému je stále diskutována. Důvodem je absence výrazného fenotypu u knock-out myší. Jedinými výjimkami jsou deficience ITAMobsahujících adaptorů imunoreceptorů a adaptoru Lat asociovaného s lipidovými rafty, které vedou k poruchám ve vývoji T-lymfocytů a jejich snížené TCR signalizaci. Cílem mé diplomové práce bylo bioinformaticky vyhledat, provést filtrování kandidátních genů na základě predikovaných a publikovaných dat a vybrané kandidátní TRAP poté částečně funkčně charakterizovat. Zjišťovala jsem jejich přítomnost na plasmatické membráně a zda-li jejich ektopická zvýšená exprese uvnitř buněk bude mít roli na expresi povrchového aktivačního znaku T-lymfocytů CD69. Ze 14 kandidátních TRAP může být pouze jediný protein Pdzk1ip1 lokalizován na plasmatické membráně, avšak jeho zvýšená exprese nemá vliv na expresi CD69 v buňkách po TCR...
|
|
|
Povrchový fenotyp nádorových kmenových buněk (CSC) lidských karcinomů
Bočková, Marie ; Drbal, Karel (vedoucí práce) ; Čermák, Vladimír (oponent)
Nádor se sestává z heterogenní masy buněk, které lze - podobně jako zdravé orgány a tkáně lidského těla - rozdělit dle morfologických, funkčních či expresních hledisek na jednotlivé buněčné populace. Populaci buněk, která dává vznik všem těmto buněčným liniím, označujeme jako nádorové kmenové buňky (CSC). Tyto CSC nejen že mají vlastnosti běžných kmenových buněk, tj. schopnost sebeobnovy a dát vzniku heterogenní populaci diferencujících se buněk, ale jsou zpravidla také nejodolnější subpopulací v nádoru, která je vysoce odolná vůči léčbě a způsobuje reziduální nemoc. Znalost CSC biomarkerů jednotlivých typů nádorů významně zvýší účinnost léčby, která může být skrze tyto biomarkery lépe zacílena. Hledání unikátního genového otisku pro CSC jednotlivých nádorových onemocnění je umožněno díky tak zvaným -omickým přístupům, zvláště charakteristice povrchového proteomu buněk, jehož prostřednictvím buňka komunikuje s okolím. Dnes je známo, že CSC karcinomu močového měchýře exprimují ve vysokých množstvích CD44, CD90 a CD49f, které jsou používané k identifikaci těchto buněk, mezi ostatními znaky ještě jmenujme molekulu CD47 s imunosupresivní funkcí.
|
host ::
RSS.