|
|
Vliv makroelementů z potravy na DNA a epigenetický profil
Veselý, Zdeněk ; Kouřilová, Xenie (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Makroelementy obsažené v potravě mají důležitou funkci pro lidský organismus. Podílí se na řadě biochemických reakcí v lidském těle a jejich vyvážené množství je důležité pro prevenci vážných onemocnění. V teoretické části bakalářské práce byla popsána funkce minerálních látek v lidském organismu, funkce DNA a epigenetických mechanismů, jako je metylace DNA nebo modifikace histonů. Byl popsán vliv výživy a funkce vybraných makroelementů – sodík, hořčík, vápník, draslík na epigenetické modifikace a na stabilitu G-kvadruplexů. Cílem experimentální části práce bylo studovat vliv těchto látek na DNA struktury in vitro a připravit experimentálně pro studium in vivo.
|
|
|
Vliv skladování na mikrobiální složení francouzského sýru Saint-nectaire
Šislerová, Lucie ; Mikulíková, Renata (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Předmětem mé práce je porovnání mikrobiálního složení mezi farmářským a mlékárenským typem sýru Saint-nectaire a vliv doby a teploty skladování na vývoj mikrobiálního složení, obsah mastných kyselin a aromatických látek. Pomocí RT-PCR byly identifikovány vybrané mikroorganismy. U farmářského typu Saint-nectaire byly oproti mlékárenskému typu navíc identifikovány Penicillium roqueforti a fuscoglaucum. U obou typů sýru bylo detekováno nejvyšší množství vybraných mikroorganismů u sýru čerstvého. Při skladování při 20 °C se objevil nárůst oproti sýru čerstvému u těchto mikroorganismů: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Cladosporium herbarum a Penicillium commune a camemberti, a dále byla zaznamenána přítomnost kontaminantů a patogenních organismů. Po týdnu skladování při 20 °C šlo o Micrococcus luteus, Salmonella enterica a Staphylococcus aureus a po dalších dvou týdnech skladování byla navíc identifikována Listeria monocytogenes. Obsah mastných kyselin a těkavých látek byl porovnán u pěti vzorků: sýr čerstvý, sýr skladovaný v lednici po dobu jednoho týdne a tří týdnů a sýr skladovaný při 20 °C po dobu jednoho týdne a tří týdnů. Byl změřen obsah vázaných a volných mastných kyselin, obojí pomocí GC-FID. Obsah vázaných mastných kyselin byl srovnatelný u všech měřených vzorků. Nejvyšší obsah volných mastných kyselin byl u sýru po třech týdnech skladování při 20 °C. Nejvíce zastoupenou mastnou kyselinou je kyselina palmitová. Těkavé látky byly stanoveny pomocí metody HS-SPME-GC-MS. Nejvíce těkavých látek bylo identifikováno v sýru po třech týdnech při 20 °C a v sýru po týdnu v lednici. Nejvíce zastoupenými skupinami byly alkoholy, ketony a kyseliny.
|
|
|
Příprava konstruktů pro izolaci proteinů a jejich testování
Osadchuk, Olha ; Kostovová, Iveta (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato práce je zaměřená na popis produkce rekombinantních proteinu. Pro studium dané problematiky byl zvolen protein p53, který je jedním z hlavních nádorových supresorových proteinu. Protein p53 je zodpovědný za regulaci mnoha genů, které mohou kontrolovat buněčný cyklus a replikaci DNA, a je nejčastěji mutovaným genem u nádorových onemocněni člověka. Pro danou prací byly zvolený různé varianty bodových mutaci proteinů p53, které mohou ovlivnit jeho vazebné vlastnosti a funkce. Znalosti mechanizmu působení mutovaných p53 proteinů v buňce je důležité pro efektivní léčbu rakoviny. V teoretické části jsou popsaný vlastnosti proteinu a jednotlivé expresní systémy, metody Gateway klonováni, a metody použité při purifikaci a izolaci proteinů (afinitní chromatografie, SDS-PAGE analýza a Western blot analýza). V experimentální časti jsou popsané postupy přípravy expresních vektoru pomoci Gateway technologie, transformace do buněk a izolace plazmidové DNA. Klonováním byly připraveny tři expresních klony a po jejich transformace do kompetentních buněk byla provedena izolace DNA.
|
|
|
Využití molekulárních technik k charakterizaci kvasinek rodu Metschnikowia
Schneiderwindová, Nicole ; Brázda, Václav (oponent) ; Němcová, Andrea (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá možnostmi provedení a využití molekulárních metod k charakterizaci kvasinek rodu Metschnikowia a také aplikací metod v biotechnologiích případně v potravinářském průmyslu. V teoretické části je zaměřená na stručný popis kvasinek, zejména vybraných druhů, které se používaly během praktické části, možnosti jejich využití, a především na detailní popis všech použitých molekulárních technik. V praktické části se zaměřuje na optimalizaci použitých molekulárních metod, konkrétně metody pulzní gelové elektroforézy (PFGE) a metody denaturační gradientové gelové elektroforézy (DGGE). Na začátku byla provedena kultivace kvasinek za optimálních podmínek, které jsou pro tento rod specifické. Dále byla pomocí izolačních technik izolována jejich DNA, která byla následně podrobena zpracování pomocí metod PFGE a PCR–DGGE. Nejvíce bylo třeba optimalizovat postup izolace DNA. Bylo provedeno několik optimalizací koncentrace lyzačních enzymů, zejména pak enzymu lytikázy. Také bylo potřeba stanovit správný poměr low-melting agarosy a izolované DNA, což bylo zásadní pro správnou konzistenci izolovaných DNA bločků a pro jejich další uplatnění při PFGE analýze. Nakonec byla provedena optimalizace metody PFGE, která přinesla správné rozdělení chromozomů, díky čemuž bylo možné jednotlivé chromozomy popsat dle jejich velikosti podle použitého standardu CHEF kvasinky Hansenula wingei. Pro správnou optimalizaci samotného procesu DGGE analýzy bylo třeba nejdříve izolovat kvasinkovou DNA pomocí kitu, tato DNA byla následně použita jako templát pro PCR reakci. Byla optimalizována také teplota annealingu pro jednotlivé skupiny použitých primerů. Amplikony, které byly získány pomocí této reakce byly separovány pomocí metody DGGE. U této techniky bylo zapotřebí především optimalizace základních parametrů jako je rozsah denaturačního gradientu či celkový čas separace. Dle výsledků měření lze určit, že postup izolace DNA kvasinek a jejich následná analýza pomocí molekulárních metod pulzní gelové elektroforézy a denaturační gradientové gelové elektroforézy byla úspěšná. Podařilo se nám alespoň částečně popsat genom a určit počet chromozomů u všech použitých druhů kvasinek rodu Metschnikowia.
|
|
|
Izolace a analýza DNA se zaměřením na mikroorganismy důležité v potravinářství
Čutová, Michaela ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Fojtová,, Miloslava (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Identifikace bakteriální DNA se skládá z několika kroků: lyze buněk, izolace a purifikace DNA, precipitace ethanolem a identifikace bakteriálního kmene pomocí PCR, případně i jiných molekulárně biologických metod. Každý krok musí být optimalizován. Nukleové kyseliny lze z buněk s výhodou izolovat pomocí magnetických nosičů. Molekuly DNA jsou na povrch magnetického nosiče navázány na základě elektrostatických interakcí a posléze jsou eluovány do pufru. Cílem práce bude optimalizace jednotlivých kroků identifikace bakteriální DNA: buněčná lyze, izolace DNA, charakterizace pevných magnetických nosičů funkcionalizovaných aminoskupinami pro izolaci nukleových kyselin. Přítomnost DNA v eluátu bude ověřena pomocí gelové agarosové elektroforézy a množství eluované DNA bude stanoveno spektrofotometricky. Kvalita izolované DNA bude bude ověřena její amplifikací s použitím polymerázové řetězové reakce (PCR). Dále je práce zaměřena na studium sekundárních struktur nukleových kyselin – křížových struktur a kvadruplexů. Tyto struktury se podílí na regulaci buněčných procesů a jejich výskyt je spojován s vývojem onkologických a neurodegenerativních onemocnění. Byla provedena analýza genomu in silico u mikroorganizmů významných v potravinářském průmyslu. Sevence genomů mikroorganismů byly získány z databáze NCBI (National Center for Biotechnology). Pro analýzu byl použit software Palindrome Analyser a G4 Hunter.
|
|
|
Biochemická analýza DNA interakčních partnerů
Valchová, Michaela ; Coufal,, Jan (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato práce byla zaměřena na analýzu DNA. Nejprve byly hybridizovány fluorescenčně značené oligonukleotidy, které byly následně podrobeny HRM analýze, kdy byly zjišťovány teploty tání oligonukleotidů v závislosti na daném prostředí. Práce popisuje změnu teploty tání oligonukleotidů v prostředí jednomocných a dvojmocných iontů a vliv vazby proteinů na stabilitu těchto struktur DNA. Z teplot tání bylo stanoveno, zda daný iont/protein stabilizuje nebo destabilizuje daný oligonukleotid. Dále byly izolovány vybrané plasmidy. Pomocí AFM byla sledována struktura izolovaných plasmidů.
|
|
|
Biologické účinky látek izolovaných z jedinců řádu Isoptera
Dušková, Simona ; Hrstka, Miroslav (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce byla zaměřena na sledování viability eukaryotických a prokaryotických buněk po působení chemických látek izolovaných z termitů. V poslední době přibývají důkazy především o antibakteriálních a antifungálních vlastnostech těchto obranných látek, které mohou najít široké využití nejen ve farmaceutickém průmyslu. V této práci byly studovány tři termití obranné látky: nerolidol, nitropentadecen a methylantranilát. Byly sledovány jejich antibakteriální účinky, minimální inhibiční koncentrace a minimální baktericidní koncentrace vůči kmenu STBL3 Escherichia coli. Dále byly studovány jejich cytotoxické účinky na eukaryotické nenádorové (HEK293FT) a nádorové buňky (MCF7) a vliv na plazmidovou DNA. Jako kontrolní látky sloužily antibiotikum ampicilin pro antibakteriální účinky a cytostatikum cisplatina pro cytotoxické účinky. V případě působení nerolidolu, nitropentadecenu a methylantranilátu na kmen STBL3 se antibakteriální aktivita neprokázala. Cytotoxické účinky se projevily u nerolidolu a nitropentadecenu. Zkoumané látky nezpůsobovaly modifikaci plazmidové DNA.
|
|
|
Bioinformatic analysis of PHA synthases of thermophilic bacteria
Brondová, Zuzana ; Brázda, Václav (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
The thesis deals with bioinformatics analysis, the aim of which was to find a suitable producer of PHA for new generation industrial biotechnologies from the collection of found thermophilic bacteria. Part of experiments was the finding of several thermophilic bacteria based on the similarity of the protein sequence of the phaC gene of the bacterium Cupriavidus necator. The next part of thesis was a literature search of the abilities of these thermophilic bacteria focused on culture conditions and the spectrum of usable substrates. Subsequently, five bacteria were selected for use in NGBI based on the information obtained. Freely available databases were used during the experimental work, and evolutionary analysis were performed in MEGA X and Operon-mapper. Rubrobacter xylanophilus with collection number DSM 9941 was selected from the collection of bacterial strains as the most promising PHA producer for NGIB. The high culture temperature of up to 70 ° C and a large amount of utilized carbohydrate substrates were considered decisive. An interesting result of the analysis was to find the gene sequences of two classes of PHA synthase – I. and III. class, as for a single bacterial strain from the entire collection. Additional genes linked to PHA metabolism were found in genome analysis.
|
|
|
Využití metody PCR pro identifikaci probiotických baktérií v mléčných potravinových výrobcích
Klaška, Dominik ; Brázda, Václav (oponent) ; Smetana, Jan (vedoucí práce)
V rámci práce byla izolována DNA z komerčně dostupného bílého jogurtu. Izolovaná DNA, která byla získána dvěma rozdílnými metodami, byla pomocí spektrofotometru podrobena analýze. Obě metody poskytly dostatečně koncentrovanou i kvalitní DNA pro další analýzu pomocí PCR. Přesně dané úseky izolované DNA byly využitím specifických primerů amplifikovány. Prostřednictvím gelové elektroforézy byla dokázána přítomnost domény Bacteria a při rodově specifické amplifikace také přítomnost bakterií rodu Lactobacillus.
|
|
|
Testování působení chemických látek na viabilitu buněčných linií
Zemanová, Anita ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Tato diplomová práce pojednává o vlivu vybraných chemických látek na viabilitu buněčných linií. V teoretické části práce jsou rozebrány poznatky o možnostech léčby rakoviny pomocí chemoterapeutik včetně jejich mechanismu působení a nežádoucích účinků. Dále jsou zde popsány alternativní struktury DNA se zaměřením na G-kvadruplexy a ligandy, které s G-kvadruplexy interagují. Tyto látky jsou považovány za slibná léčiva při boji proti rakovině díky jejich vysoké specifitě vůči G-kvadruplexům nacházejících se v telomerách chromozomů. Ligandy interagující s G-kvadruplexy stabilizací G-kvadruplexů mohou inhibovat enzym telomerasu nezbytnou pro prodlužování telomer rychle se dělících nádorových buněk. Dále jsou v teoretické části shrnuty možnosti testování viability. Cílem experimentální části bylo porovnání cytotoxické aktivity mezi komerčně dostupnými chemoterapeutiky a vybranými ligandy interagující s G-kvadruplexy. Dalším úkolem bylo studium apoptózy a nekrózy po působení vybraných chemických látek na buněčné linie a následně proběhla i lokalizace ligandů interagujících s G-kvadruplexy v buňkách nádorové buněčné linie karcinomu prsu. V rámci experimentální části bylo zjištěno, že ligandy interagující s G-kvadruplexy vykazují podobnou cytotoxickou aktivitu jako komerčně dostupná chemoterapeutika.
|
host ::
RSS.