|
|
Development of inhibitors of rhomboid proteases as tools for the study of their biological functions
Tichá, Anežka ; Stříšovský, Kvido (vedoucí práce) ; Šedo, Aleksi (oponent) ; Konvalinka, Jan (oponent)
Rhomboidy jsou serinové membránové proteasy, které patří do evolučně rozšířené rodiny rhomboidních proteinů. Rhomboidy si ve srovnání s klasickými serinovými proteasami vyvinuly odlišný katalytický mechanismus; místo běžně triády (Ser/His/Asp) k proteolýze využívají pouze katalytickou dyádu (Ser/His) a jejich aktivní místo se nachází uvnitř lipidové membrány, což - společně s faktem, že jsou hydrofobní - komplikuje jejich studium. Přestože je známé jejich zapojení v mnoha důležitých biologických procesech, stále u většiny rhomboidů není jasný konkrétní mechanismus, kterým přispívají k regulaci těchto procesů nebo k patologickým projevům souvisejících onemocnění (jako např. malárie, Parkinsonova choroba nebo rakovina). Pochopení těchto dějů je ztíženo nedostatkem nástrojů k jejich studiu jak in vitro, tak in vivo. Ve své práci uvádím nové fluorogenní substráty založené na Försterově rezonančním přenosu energie (FRET) a odvozené od sekvence LacYTM2, které umožňují široké využití pro kontinuální sledování aktivity mnoha rhomboidů in vitro. Modifikacemi v P5-P1 pozicích je možné zvýšit specifitu substrátu k cílovému rhomboidu, zatímco výběr FRET páru fluoroforů absorbujícího v červené oblasti viditelného světla umožňuje jejich využití pro rychlé testování knihoven molekul. Selektivní a účinné...
|
|
|
Development of analytical tools for quantification and screening for inhibitors of glutamate carboxypeptidases II and III
Navrátil, Václav ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Šedo, Aleksi (oponent)
Glutamát karboxypeptidasa II (GCPII), známá také jako prostatický specifický membránový antigen (PSMA), je membránová metalopeptidasa exprimovaná zejména na buňkách karcinomu prostaty (PCa). Látky cílící GCPII pro zobrazování a léčbu PCa jsou ve vývoji a ukazují nadějné výsledky v pokročilých fázích klinického testování. Některé studie ukázaly, že GCPII by mohla být využita také jako krevní marker PCa, což ale zatím nebylo potvrzeno kvůli absenci metod vhodných pro přesnou detekci GCPII v krvi. GCPII je exprimována také v mozku, kde štěpí inhibiční N-Acetyl-α-L-aspartyl-L- glutamát (NAAG) na excitační L-glutamát a inhibice GCPII je neuroprotektivní ve zvířecích modelech několika neuropatií. Silné inhibitory GCPII byly nalezeny pomocí racionálního vývoje, ale všechny vykazují nedostatečnou biodostupnost aby mohly být využity v klinické praxi. Nalezení nových strukturních motivů je tedy nezbytné, nicméně zatím nebyla vyvinuta žádná metoda vhodná pro účinné testování inhibitorů GCPII. V mozku se nalézá také málo prozkoumaná glutamát karboxypeptidasa III (GCPIII), která také štěpí NAAG. Její studium je tak nutné pro pochopení funkce GCPII a pro cílení GCPII v medicíně. V této práci jsme se zaměřili na vývoj nových metod pro kvantifikaci obou enzymů a pro hledání jejich inhibitorů. Nejprve jsme vyvinuli...
|
|
|
Struktura a funkce glutamátkarboxypeptidasy II
Šácha, Pavel ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Šedo, Aleksi (oponent) ; Blahoš, Jaroslav (oponent)
4 Závěr GCPII je důležitý protein, který hraje roli v mnoha fyziologických i patologických procesech. Proto bylo třeba získat větší množství enzymaticky aktivního proteinu pro jeho další biochemický výzkum. Heterologní expresí v hmyzích buňkách S2 bylo exprimováno a následně purifikováno dostatečné množství velmi čistého a aktivního enzymu. To umožnilo jeho biochemickou charakterizaci, krystalizaci a později vedlo i k vyřešení krystalové struktury. GCPII je aktivní v širokém rozmezí pH 6 - 8, s maximem kolem pH 7,5. Zjistili jsme, že kromě přirozeného substrátu Ac-Asp-Glu GCPII štěpí také acetylované dipeptidy Ac-Asp-Met, Ac-Glu-Met, Ac-Glu-Glu, Ac-Ala-Glu a Ac-Ala-Met. U těchto substrátů byly změřeny kinetické parametry štěpení. Nalezení dalších substrátů může vést k objevení dosud nepopsaných fyziologických rolí GCPII. Také byly porovnány hodnoty IC50 inhibitorů známých z literatury u námi připravené GCPII a GCPII izolované z potkaních mozků. IC50 bylo u všech méně specifických inhibitorů nižší u rekombinantní GCPII než u GCPII izolované z mozků. Rozdíly ve výsledcích vysvětlujeme vazbou méně specifických inhibitorů na jiné proteiny preparátů z mozku. Vůbec nepochybujeme o tom, že data získaná za použití čistého rekombinantního proteinu jsou přesnější než ta, ktará byla získána ze špatně definovaných...
|
|
| |
|
| |
|
|
Dipeptidyl peptidáza-IV a Fibroblastový aktivační protein v gliomagenezi.
Trylčová, Jana ; Šedo, Aleksi (vedoucí práce) ; Mandys, Václav (oponent) ; Mareš, Vladislav (oponent)
"Dipeptidylpeptidáze-IV aktivitou a/nebo strukturou homologní" (DASH) molekuly představují skupinu multifunkčních molekul, z nichž většina nese hydrolytickou aktivitu podobnou dipeptidylpeptidáze-IV (DPP-IV), která odštěpuje X-Pro dipeptidy od N-konce peptidů a bílkovin. Do této skupiny patří další molekuly nesoucí podobnou enzymovou aktivitu jako například fibroblastový aktivační protein (FAP), DPP-II, DPP8 a DPP9 nebo i DPP-IV strukturou podobné, ale hydrolyticky neaktivní molekuly (DPP6 a DPP10). Současné poznatky svědčí o významu těchto molekul v procesech vzniku a rozvoje řady nádorových onemocnění. Cílem této práce je příprava biologického modelu a jeho využití pro pochopení mechanizmů interakce transformovaných gliálních buněk s buňkami stromatu v procesech vzniku a rozvoje nádorů odvozených z neuroektodermu. V rámci projektu byly připraveny stabilně transfekované lidské glioblastomové buněčné linie s indukovatelnou expresí DPP-IV a fibroblastového aktivačního proteinu a jejich mutantních, enzymově neaktivních forem. Vzniklé buněčné linie jsou nadále používány nejen jako nástroj studia "autokrinního" významu DPP-IV a FAP pro vlastní exprimující transformované buňky v in-vitro modelech, tak i "parakrinního" působení na úrovni nádorového mikroprostředí po homotopní implantaci do...
|
|
|
Structure, activity and metabolism of human glutamate carboxypeptidase II
Mlčochová, Petra ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Blahoš, Jaroslav (oponent) ; Šedo, Aleksi (oponent)
ZAVER Nedávno publikované krystalové stÍuktuly GCPII poskytly náhled do organizace vazebné kapsy pro substrát a odhali|y něko|ik aminokyse|in, které se podílejína vazbě substrátu/inhibitoru vsl' místě enzymu. Abychom doplnili a rozšíři|istrukturní studie, vytvořili jsme QM/T\4M model GCPII v komplexu se substrátem, N.acetyl-aspartyl. glutamátem (NAAG). To nám umožnilo předpovědět dalšíaminokyseliny důleŽitépro vazbu substrátu. Využili jsme místně speciťrcké mutageneze. abychom odhalili vliv těchto jednotlivých aminokyselin na vazbu substÍátu/inhibitoru a na enzymovou aktivitu GCPII. Poěítačovýmodel komp|exu GCPIVNAAG společněs výsledky z místně specifické mutageneze, ukazuje žeaminokyse|iny v S1' místě (váaající glutarát) jsou nezbytné pro vysokou ďinitu substrátu nebo inhibitoru, zatímco, zbytky v s1 místě jsou více dťúežitépři přeměně substrátu a mohly by hrát nějakou roli v kata|ytickém mechanismu enzymu. Přestože QMA4M model nám umožni|předpovědět strukturu a interakce mezi substrátem a enzymem v Sl místě, komp|exní popis reakčníhomechanismu GCPII je zatím mimo rámec našich možností. V blízkébudoucnosti bychom se rádi dozvěděli víceinformací o katalytickém mechanismu GCPII. Chceme se zaměřit na Glu424' který je situovián v bezprostřední blízkosti zinkťr v aktivním místě a s největší pravděpodobností se...
|
|
| |
|
|
Posttranslational modifications in soluble recombinant therapeutical proteins secreted by lower aukaryotes: structure and function
Kumar, Vinay ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Šedo, Aleksi (oponent) ; Grubhoffer, Libor (oponent)
Virral, Kunnr M.Sc Cíle dizertačnípráce cÍrn DISERTAČNÍpnÁcn Cílenr předkládarré dizertačrrípráce byIo poclropení rlolekulánríclr nleclranisnrů přispívajících ke tvorbě vysoce stabilních rozpustlrýc|r |orern receptorů přirozených zabíječských buněk. Jako modelový protein byl r.ybrán receptor CD69. Tento receptor je v přirozerrénl prostředí produkovárr jako dinlenrí nterrrbránor.ý protein stabilizovaný ponrocí 7 disulfidovýclr nrůstků a glykosylovaný na 4 nlístech ,\.-gl1.kosylací. Konkrétně byly v práci vytčeny následujícící|e: l. Vyvirrout nor'ou tlletodologii pro rychléa cit|ivé stanovení struktury disulfidových nrůstkůu sloŽitých eukaryotických proteirrů zaloŽenou na SDS polyakrylanlidové elektroťorese l'neredukujícíchpodrnírrkách a hnlottrosttrí spektrorrretrii. 2. Na|ézt základní struktunlí elenlenty kritické pro stabiIitu rozpustných CD69 receptorů produkovanýc|r v bakteriálnínl exprestrínr systénlu. 3. Vyvinout nretodu pro produkci glykosylovanýclr forenr rozpustných CD69 receptorů s použitínr vybraných kmenů kvasinky Pichia pastot.is. 4. Produkor'ané proteirry přečistit v nrlroŽství a čistotě dostatečnýclrpro biochelrrická stanor'etrí a inrunologické testy \,četně testů l/i l'll'o' 5. ZjistiÍ, jakým způsobetn tlroltou tvorba disu|fidových rrrůstkůa g|ykosylace ovlivnit stabilitu rozpustrrých CD69...
|
|
| |
host ::
RSS.