|
|
Functional characterization of MDR pump Pdr5p responsible for multiple drug resistance in yeast Saccharomyces cerevisiae
Sayedová, Shirin ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Jedním z hlavních důvodů selhávání léčby infekcí způsobených patogenními mikroor- ganismy je nadměrná exprese membránových proteinů, které aktivně odstraňují léky z buněk, což vede k fenoménu zvanému mnohočetná léková rezistence MDR. V této práci jsme se zaměřili na funkční charakterizaci MDR pumpy Pdr5p u kvasinky Saccharomyces cerevisiae. Ověřili jsme, že je možné použít dis-C3(3) fluorescenční metodu pro stanovení vazebných míst, do kterých se substráty vážou ve vazebné kapse pumpy ScPdr5p. Zaměřili jsme se na studium vazebné kapsy ScPdr5p pomocí triazolových derivátů: ravukonazolu, vorikonazolu a flukonazolu. Pomocí zónového testu jsme ukázali, že všechny tři studo- vané triazoly jsou substráty pumpy ScPdr5p. Zjistili jsme, že tyto strukturní analogy mají výrazně odlišný vliv na inhibici transportu potenciometrické fluorescenční sondy dis-C3(3) pumpou ScPdr5p, a také, že ravukonazol s vorikonazolem vzájemně kompetují o transport pumpou ScPdr5p. Využili jsme fluorescenční přístup ke studiu vazby azolů do vazebné kapsy pumpy ScPdr5p pomocí benchmark substrátů, které se vážou selek- tivně pouze do jednoho vazebného místa ve vazebné kapse pumpy ScPdr5p, a podpořili jsme tak hypotézu, že ravukonazol a vorikonazol se vážou do více než jednoho vazebného místa. 1
|
|
|
Studies on molecular interactions of the mu-opioid and TRPV1 receptors
Melkes, Barbora ; Novotný, Jiří (vedoucí práce) ; Blahoš, Jaroslav (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
V této práci jsme zkoumali chování -opioidního receptoru (MOR) a iontového kanálu TRPV1 (transient receptor potential vanilloid 1) v plazmatické membráně buněk a jejich vzájemnou komunikaci. Oba tyto receptory se podílejí na vnímání bolesti a analgezii. Zjistili jsme, že laterální pohyblivost MOR byla silně ovlivněna různými usměrňujícími opioidními agonisty. DAMGO a endomorfin-2 vykazují opačný usměrňovací agonismus vůči MOR. Podle našich výsledků mají také opačné účinky na mobilitu MOR. Morfin vyvolal pouze malé změny v mobilitě MOR. Kromě toho, deplece cholesterolu a blokování G proteinové signalizace za pomoci pertusového toxinu (PTX) ovlivňovaly schopnost agonistů MOR měnit jeho mobilitu. Účinky DAMGO a endomorfinu-2 byly za těchto podmínek sníženy. Na druhé straně jsme pozorovali morfinem zvýšený pohyb MOR po depleci cholesterolu. Samotný PTX neovlivnil pohyb receptoru, ale zcela narušil účinek deplece cholesterolu na morfinem vyvolanou změnu mobility MOR. Dále jsme se zabývali mobilitou TRPV1. Agonista TRPV1 kapsaicin změnil laterální mobilitu TRPV1. Překvapivě, po přidání MOR antagonisty naloxonu se také zvýšil difúzní koeficient TRPV1, ale v menší míře než po kapsaicinu. Agonista MOR DAMGO a antagonista levallorfan neovlivnily mobilitu TRPV1. Zjistili jsme, že kapsaicin i naloxon byly...
|
|
|
Neuroinflammation and mechanisms of neuropathic pain development
Kalynovska, Nataliia ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Hejnová, Lucie (oponent)
Neuropatická bolest se nejčastěji objevuje po poškození nervové tkáně a také jako doprovodný příznak u řady onemocnění nebo jako nežádoucí vedlejší účinek některých cytostatických léčiv. V současné době neuropatická bolest představuje významný klinický problém, jelikož aktuálně dostupná analgestická léčba je stále neuspokojivá. Pro rozvoj nových účinných léčebných postupů neuropatické bolesti je důležité odhalit mechanizmy jejího vzniku. Stále však chybí přesné informace o procesech, které se podílejí na vývoji a udržování neuropatické bolesti. Cílem této dizertacní práce bylo prozkoumat mechanizmy zapojené do vzniku neuropatických bolestivých stavů u několika modelů. Hlavní část práce je zaměřená na studium protizánětlivého účinku blokátoru angiotenzinových receptorů typu 1 (AT1R), losartanu, u dvou již etablovaných modelů periferní neuropatie a to navozené podáním cytostatika paclitaxelu (PIPN) nebo podvázáním míšního nervu (SNL). Další část této práce je věnována zkoumání úlohy vaniloidních receptorů typu 1 (TRPV1) u procesů aktivace míšních neuronů pod vlivem aplikace chemoterapeutika paclitaxelu nebo chemokinu CCL2. Pro dosažení postavených cílů byly použity jak behaviorální, tak i molekulárně biologické metody. U každého modelu byly měřeny odpovědi potkanů na tepelné/mechanické podněty, které...
|
|
|
Study of the differences in the architecture of the binding pockets of two major MDR pumps of yeast Saccharomyces cerevisiae, Pdr5p and Snq2p, using their common substrates
Backová, Lenka ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Mnohonásobná lieková rezistencia (multidrug resistance, MDR) je zodpovedná za po- kles účinnosti liekov na patogénnych mikroorganizmoch alebo nádorových ochoreniach. Jeden z mechanizmov mnohonásobnej liekovej rezistencie je export liekov z bunky pomo- cou membránových transportérov - púmp. Hlavné MDR pumpy kvasinky Saccharomyces cerevisiae sú Pdr5p a Snq2p, ktoré majú vysokú aminokyselinovú sekvenčnú podobnosť. Táto práca sa sústredí na rozdiely týchto púmp, ich väzobné kapsy a ich usporiadanie. Väzobná kapsa pumpy Pdr5p je lepšie preskúmaná, porovnanie výsledkov z merania me- dzi pumpou Pdr5p a Snq2p vedie k rozšíreniu znalosti o väzobnej kapse Snq2p. Pomocou zónového testu určíme spoločné substráty púmp, ketokonazol a bifonazol. Tieto substráty použijeme v meraní pomocou metódy potenciometrickej fluorescenčnej sondy diS-C3(3). Z výsledkov sme zistili, že väzobná kapsa Snq2p má viac väzobných miest. Väzobné kapsy Pdr5p a Snq2p sa navzájom líšia vo väzobných miestach a ich konformá- cii. Avšak konformácia oboch púmp je dynamická, k čomu sme dospeli z výsledkov po pridaní glukózy k bunkám na dodanie energie. 1
|
|
|
Vliv strukturních a farmakologických determinant na proces otevírání kanálu NMDA receptoru
Ladislav, Marek ; Krůšek, Jan (vedoucí práce) ; Bendová, Zdeňka (oponent) ; Zemková, Hana (oponent)
N-metyl-D-aspartátové (NMDA) receptory jsou heterotetramery, složené ze dvou obligatorních glycin-vázajících GluN1 podjednotek a dvou glutamát/glycin vázajících GluN2/3 podjednotek. Tyto receptory zprostředkovávají rychlý synaptický přenos v centrální nervové soustavě, přičemž hrají výraznou roli při vývoji mozku a synaptické plasticitě, která je základním mechanismem procesu učení a paměti. Bylo prokázáno, že dysfunkce NMDA receptorů je spjata s několika neurologickými a psychiatrickými poruchami. NMDA receptory mají specifickou doménovou organizaci. Extracelulárně nejvzdáleněji od membrány se nachází amino-terminální doména, na kterou směrem k membráně navazuje ligand vázající doména (LBD), kde se vážou agonisté. LBD je propojena třemi krátkými polypeptidovými řetězci - linkery s transmembránovou doménou (TMD), kde se nachází vlastní iontový kanál. Receptor je na intracelulární straně zakončen karboxy-terminální doménou. Proces otevírání iontového kanálu NMDA receptoru zahrnuje několik kroků a je založen na funkčním propojení mezi LBD-linkery-TMD, kdy navázáním agonistů do LBD dochází ke konformační změně, jejíž energie je přenášena linkery na TMD, čímž dochází k otevření iontového kanálu. Detaily tohoto přenosu nejsou stále zcela charakterizovány, i když přesná znalost mechanismu otevírání...
|
|
|
Studium transportních systémů mikroorganismů
Jančíková, Iva ; Gášková, Dana (vedoucí práce) ; Amler, Evžen (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
Název práce: Studium transportních systémů mikroorganismů Autor: Mgr. Iva Jančíková Katedra / Ústav: Fyzikální ústav Univerzity Karlovy Vedoucí disertační práce: doc. RNDr. Dana Gášková, CSc., Fyzikální ústav UK Abstrakt: Nadprodukce transportních proteinů, které aktivně odstraňují cizorodé látky z buněk, je zodpovědná za fenomén nazývaný mnohočetná léková rezistence (MDR). Zjištění, že potenciometrická fluorescenční sonda diS-C3(3) je substrátem hlavních MDR pump u tří druhů kvasinek, Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis a Candida albicans, nám umožnilo použít diS-C3(3) fluorescenční metodu pro sledování inhibice činnosti těchto membránových transportérů účinkem různých chemických stresorů (společných substrátů). Z porovnání míry inhibice transportu sondy pumpami ScPdr5p a KlPdr5p vyplynulo odlišné uspořádání jejich vazebné kapsy, které je v případě KlPdr5p těsnější. U kvasinky K. lactis jsme dále zjistili, že zatímco delece genu KlPDR16 neovlivňuje aktivitu KlPdr5p, vede pouze k hyperpolarizaci buněk, delece genu KlERG6 se projeví jak změnou membránového potenciálu, tak potlačením činnosti KlPdr5p. Skutečnost, že sonda je substrátem nejenom dvou hlavních pump ScPdr5p a ScSnq2p u S. cerevisiae, ale také dvou hlavních pump CaCdr1p a CaCdr2p u C. albicans, nám umožnila vyvinout efektivní postup pro...
|
|
|
Modulace synaptického přenosu nociceptivní informace
Nerandžič, Vladimír ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Hejnová, Lucie (oponent)
Modulace synaptického přenosu v zadních rozích míšních představuje důležitou součást rozvoje a udržování patologických bolestivých stavů. Nezastupitelnou roli v této modulaci hrají tzv. transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) a kanabinoidní receptory 1 (CB1) exprimované na presynaptických zakončeních primární aferentů. Za fyziologických podmínek jsou TRPV1 receptory pronociceptivní, zatímco CB1 receptory tlumí nociceptivní signalizaci. Oba receptory však sdílejí stejného endogenního agonistu anandamid (AEA), který je syntetizován z N-arachidonoylfosfatidylethanolaminu (20:4-NAPE). Tato práce se zaměřuje především na účinek aplikace 20:4-NAPE za kontrolních podmínek a po navození periferního zánětu a na související možnou interakci mezi TRPV1 a CB1 receptory. První pokusy prokázaly výrazné zvýšení hladiny anandamidu za podmínek in vitro z míšních řezů po aplikaci 20:4-NAPE, jeho prekurzoru. Další experimenty byly prováděny snímáním excitačních postsynaptických proudů (mESPC a sEPSC) v superficiálních neuronech zadních rohů míšních na akutních míšních řezech metodou patch-clamp. Aplikace 20:4-NAPE vedla k výraznému poklesu frekvence mEPSC a sEPSC proudů. Za kontrolních podmínek byl tento pokles frekvence po aplikaci 20:4-NAPE blokován aplikací inhibitorů CB1...
|
|
|
Studium molekulárních mechanismů funkce 14-3-3 proteinů
Šilhán, Jan ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Závěr Hlavním cílem této doktorské práce bylo objasnění molekulárních mechanismů funkce 14-3-3 proteinů a vlivu na proteiny FOXO4 a tyrosinhydroxylasu. V první časti této práce (publikace I) byla potvrzena předložená hypotéza polohy Cterminálního konce molekuly 14-3-3. Bylo ukázáno, že v nepřítomnosti ligandu se Cterminální konec nachází ve vazebném místě a brání tak vstupu ligandů. Po vazbě fosforylovaných ligandů, dochází k velmi silné vazbě a vytěsnění C-terminálního konce 14-3- 3 proteinu z vazebného místa. Tyto výsledky jsou v souladu s původními pracemi, které navrhly důležitost tohoto segmentu jako inhibitoru nepatřičných ligandů. Druhá část této doktorské práce poskytuje rozsáhlý popis vlivu 14-3-3 proteinů na transkripční faktory FOXO4. S použitím stacionární a časově-rozlišené fluorescence byla studována interakce 14-3-3 proteinu s fosforylovaným transkripčním faktorem FOXO4. Navázání 14-3-3 proteinu způsobuje rozpad komplexu FOXO4:DNA. Tato část práce charakterizuje interakci 14-3-3 proteinu s DNA-vazebnou doménou FOXO4. Výsledky neprokázaly výrazné konformační změny v rámci DNA-vazebné domény. Spíše dochází ke sterickému bránění vazby DNA (publikace II). Ve třetí části se práce zabývá studiem interakcí 14-3-3 s fosforylovaným ligandem odvozeným od C-konce enzymu serotonin N-acetyltransferasa...
|
|
| |
|
| |
host ::
RSS.