|
|
Cellular protein interactions studied by advanced fluorescence imaging methods
Belejová, Sára ; Heřman, Petr (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Táto diplomová práca sa venuje štúdiu dôležitého nádorového supresoru, p53, a jeho interakčného partnera, nukleofosminu (NPM) v živých bunkách. Proteíny sú skúmané pomocou fluorescenčných konfokálnych techník ako sú: mikroskopia zobrazovania doby života a zobrazovanie fluorescenčnej anizotropie. Práca je primárne zameraná na L344P mutant proteínu p53wt a jeho interakciu s NPM. V práci skúmame oligomerizačný stav proteínu p53-L344P in vivo, ktorý sa javí byť za fyziologických podmienok monomerický potvrdzujúc výsledky in vitro meraní iných štúdií. Ďalej ukazujeme, že proteíny p53wt a p53-L344P spolu tvoria v bunečnom jadre komplexy. Neskôr porovnávame interakciu proteínu NPMmutA s p53wt a p53-L344P. V našich zisteniach ukazujeme, že mutant L344P nie je pomocou NPMmut vyťahovaný z bunečného jadra do cytoplazmy ako je tomu v prípade p53wt. V práci tak�ež skúmame oligomerizačný stav proteínu p53wt, potom, čo bol vy�ahnutý do cytoplazmy. V diskusii navrhujeme ďalšie cesty skúmania interakcie týchto dvoch proteínov.
|
|
|
Vliv NMDA antagonistů na neuroplasticitu jako biologický fenomén
Kalivodová, Michaela ; Valeš, Karel (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Neuroplasticita je zásadní biologický fenomén, který nás provází po celou dobu našeho života, jak ve zdraví, tak v nemoci. Její studium nám umožňuje pochopit závažná neurodegenerativní onemocnění, remodelaci nervového systému po poškození, nebo zefektivnit naše počínání v dnešním světě. Tato práce se v první kapitole bude zabývat neuroplasticitou ve fyziologickém stavu, kde bude popsán vývoj nervové soustavy, učení a paměť, různé typy neuroplasticity a možnosti jejího ovlivnění nejen NMDA antagonisty, ale i jinými způsoby. Následující kapitola se zabývá rolí neuroplasticity v nemoci, jejímu poškození v neuropsychiatrických chorobách. Budou popsány hlavně ty nejběžnější, kterými jsou deprese, schizofrenie, Alzheimerova choroba a Parkinsonova choroba. V další části práce bude rozebrána NMDA molekulární biologie zahrnující strukturu, aktivaci a excitotoxicitu NMDA receptoru, jako velice odlišného receptoru oproti jiným. Následně budou blíže popsáni vybraní NMDA antagonisté kompetitivní, nekompetitivní, unkompetitivní, dále agonisté glycinu a jiné vybrané přirozené modulátory NMDA receptoru. Na závěr této práce budou představeny molekulární a buněčné mechanismy BDNF a mTOR dráhy, jejichž znalost je podkladem pro další chápání dějů spojených s vývojem, růstem a celkovou remodelací nervové soustavy.
|
|
|
The role of nociceptive synaptic transmission modulation
Heleš, Mário ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Rokyta, Richard (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
Bolest je hlavním příznakem mnoha onemocnění a často se může stát hlavním negativním faktorem nízké kvality života pacienta. Komplexní problematiku léčby bolesti dále podtrhuje snížená účinnost konvenčních analgetik např. u neuropatické bolesti. Neuropatická bolest na rozdíl od akutní nociceptivní bolesti vzniká v důsledku poškození periferního nebo centrálního nervového systému a často přechází v syndrom chronické bolesti. Většina dnes dostupných analgetik poskytuje u chronické neuropatické bolesti pouze omezenou a neuspokojivou analgezii, která je často spojena se závažnými nežádoucími účinky. Modulace nociceptivního přenosu v zadním rohu míchy (SCDH) je považována za klíčový mechanismus při vzniku a udržování zejména chronické bolesti. Hlavním cílem této disertační práce bylo studovat, jak modulační procesy synaptického přenosu v zadním rohu míšním ovlivňují analgezii navozenou opioidy. Práce byla zaměřena zejména na interakci mezi CCL2 (z angl. chemokine (C-C motif) ligand 2), TRPV1 (z angl. transient receptor potential vanilloid type 1) a μ-opioidním receptorem (MOR). Pro pochopení modulačních vlivů opioidní signalizace v SCDH jsme si položili následující otázky: (I.) Jak CCL2 moduluje účinky aktivace MOR na nociceptivní synaptický přenos v neuronech SCDH in vitro a in vivo během opioidy...
|
|
|
Objasnění vlastností a struktury pórotvorné domény kolicinu U bakterie Shigella boydii
Dolejšová, Tereza ; Fišer, Radovan (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Osička, Radim (oponent)
Kolicin U je protein produkovaný bakterií Shigella boydii. Řadí se do skupiny pórotvorných kolicinů, které interagují s receptory ve vnější membráně bakterií blízce příbuzných produkčnímu kmeni. Následně je kolicin translokován přes vnější membránu a periplazmu. Nakonec se váže do cytoplazmatické membrány, kde tvoří transmembránové póry, které tuto membránu depolarizují, a v důsledku pak způsobují zánik buňky. Pórotvorné vlastnosti kolicinu U zatím nebyly podrobně studovány, proto jsem se ve své práci rozhodla tímto tématem zabývat. Ukázalo se, že póry kolicinu U jsou pravděpodobně tvořeny jedinou molekulou kolicinu a jsou napěťově ovládané. Kromě toho, měřením s neelektrolyty bylo možné stanovit přibližný vnitřní průměr póru (0,7-1 nm) a také byl určen jeho teoretický vnitřní profil. V neposlední řadě se tato práce zabývá uspořádáním membránových α-helixů pórotvorné domény kolicinu U v otevřeném stavu. S využitím biotinylačního značení bylo zjištěno, že po otevření kolicinového póru, dochází k translokaci části pórotvorné domény na opačnou stranu membrány. Konkrétně se ukázalo, že aminokyseliny na pozici F463 a D486 (mezi α-helixy H2-H4) jsou po otevření póru přítomné na trans straně membrány. Na závěr se tato práce také zabývá vlastnostmi peptidu H1, který odpovídá části prvního α-helixu...
|
|
|
Properties and interactions of nucleoproteins studied by advanced lifetime-based imaging methods
Vacková, Anežka ; Heřman, Petr (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Hlavním cílem této práce bylo zavedení a testování nové zobrazovací metody pro výzkum protein-protein interakcí v naší laboratoři a rozšíření již zavedené metody heteroFRET (Försterův rezonanční přenos energie) používané s fluorescenčním zobrazováním doby života (FLIM). Prováděli jsme homoFRET experimenty jak metodou zobrazování ani- zotropie v ustáleném stavu, tak metodou časově rozlišeného anizotropního zobrazování. Přítomnost homoFRETu mezi fluorofory byla provedena částečným vybělením fluoro- forů a "red edge" metodou. Porovnali jsme jednotlivé metody, zejména jejich citlivost, experimentální náročnost, komplexnost a informační hodnotu. Efektivně jsme použili zobrazování v ustáleném stavu a časově rozlišené anizotropie u šesti vybraných proteinů; obě metody se pro detekci interakcí proteinů prokázaly srovnatelně účinné a spolehlivé jako heteroFRET-FLIM. Metoda "red edge" se jeví jako problematická kvůli příspěvku pozadí, které nebylo možné potlačit pomocí současného experimentálního uspořádání a vybavení laboratoře. Jak časově rozlišené anizotropní zobrazování, tak zobrazování anizotropie v ustáleném stavu bylo validováno na již popsaných oligomerizujících variantách nukleofosminu (NPMwt a NPMmut) a neinteragující mutantní formě NPMcut. Dále jsme zkoumali nukleolin (NCL) a volné fluorescenční značky...
|
|
|
Úloha Bmh proteinů v regulaci kvasničného enzymu neutrální trehalasy Nth1.
Macáková, Eva ; Obšilová, Veronika (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent) ; Žáčková, Markéta (oponent)
116 9. Souhrn Neutrální trehalasa 1 je kvasničný enzym z rodiny hydrolas, který katalyzuje štěpení trehalosy na dvě molekuly glukosy. Trehalosa je neredukující disacharid, který slouží v buňkách kvasinek jako zdroj uhlíku a také jako stresový metabolit. Buňka v teplotním či chemickém stresu nahromadí trehalosu, které je v rámci zotavení se po ukončení stresových podmínek hydrolyzována trehalasou. Předmětem našeho výzkumu byla Nth1 ze S. cerevisiae. Jak bylo publikováno dříve (Panni, S., et al., 2008), Nth1 musí být fosforylována PKA a v přítomnosti kvasničné isoformy proteinu 14-3-3, aby byla aktivní. Aktivita také v menší míře vzroste v přítomnosti iontů Ca2+ (Franco, A., et al., 2003). Proteiny 14-3-3 jsou kyselé regulační proteiny, které se vyskytují ve všech eukaryotických organismech a účastní se řady buněčných dějů, jako je regulace buněčného cyklu, buněčný metabolismus, tranksripce, apoptosa a další. Proteiny 14-3-3 mají přes 400 známých vazebných partnerů, mezi které patří transkripční faktory, signalizační molekuly, enzymy a další. Své vazebné partnery regulují skrze fosforylované vazebné motivy, a to změnou jejich konformace, odkrýváním či zakrýváním specifické sekvence či zprostředkováním protein-protein interakcí. Proteiny 14-3-3 se vyskytují v mnoha isoformách v různých organismech, v...
|
|
|
Stavy patologické bolesti, úloha modulace míšního synaptického přenosu
Nerandžič, Vladimír ; Paleček, Jiří (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Modulace synaptického přenosu v zadním rohu míšním hraje klíčovou úlohu v nociceptivní signalizaci. Studie z poslední doby naznačují velký význam míšních presynaptických TRPV1 (transient receptor potential vanilloid) receptorů, které na periferii působí jako integrátory nociceptivních podnětů. Mechanismy jejich aktivace a jejich vliv na modulaci synaptického přenosu ale nejsou dosud zcela známy. Předchozí studie také ukázaly vliv řady mediátorů zánětu a cytokinů na funkci TRPV1 receptorů. Cílem naší studie bylo proto ukázat, jak se mění aktivace presynaptických TRPV1 receptorů v míše po aplikaci endogenního agonisty N-oleoyldopaminu (OLDA) u modelu periferní neuropatie, po inkubaci s cytokinemTNFα a jaký je účinek prekurzoru anandamidu N-acylfosfatidylethanolaminu (NAPE). V experimentech byly snímány miniaturní excitační postsynaptické proudy (mEPSC) na neuronech akutních míšních řezů metodou patch clamp. V první sérii experimentů byla testována citlivost na aplikaci endogenního agonisty OLDA 5 dnů po navození modelu periferní neuropatie. Aplikace již nízké koncentrace OLDA (0,2 μM) výrazně zvýšila frekvenci mEPSC na 250 % kontrolní hodnoty, na rozdíl od snímání u kontrolních experimentů kde je ke zvýšení potřeba vysoké koncentrace OLDA (10 μM). Inkubace řezů s TNFα ve druhé řadě pokusů u stejného...
|
|
|
Změny vnitrobuněčného pH kvasinek za stresových podmínek
Divín, Radek ; Plášek, Jaromír (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Název práce: Změny vnitrobuněčného pH kvasinek za stresových podmínek Autor: Radek Divín Katedra / Ústav: Fyzikální ústav Univerzity Karlovy Vedoucí diplomové práce: prof. RNDr. Jaromír Plášek, CSc. Abstrakt: Specifické hodnoty intracelulárního pH (pHi) mohou ovlivnit veškeré biochemické procesy v buňce, což je důvodem důležitosti studia změn intracelulárního pH za stresových podmínek. V práci bylo využito kvasinek Saccharomyces cerevisiae jakožto modelového organismu eukaryotních buněk. Monitorování intracelulárního pH buněk bylo prováděno metodou sychronního skenování fluorescence geneticky kódované fluorescenční sondy pHluorin, lokallizované v cytosolu buněk. Buňky byly vystaveny stresovým podmínkam vlivem chemických změn prostředí. Studovala se schopnost buněk udržet si stálou hodnotu intracelulárního pH v různě kyselých prostředích. Pozornost se věnovala také vlivu glukózy na optimalizování cytosolického pH. Práce se zabývá i změnami intracelulárního pH pod vlivem přítomnosti KCl v suspenzi. Dále se monitoroval pokles cytosolického pH buněk působením protonoforu CCCP. Vliv stresového prostředí na intracelulární pH byl studován z pohledu variací chemických látek a jejich množství v buněčné suspenzi a dále i z pohledu růstové fáze zkomaných buněk. Klíčová slova: Saccharomyces cerevisce, vnitrobuněčné pH,...
|
|
|
Inhibice nikotinového acetylcholinového receptoru takrinem a jeho deriváty
Skřenková, Kristýna ; Krůšek, Jan (vedoucí práce) ; Doležal, Vladimír (oponent)
Nikotinové acetylcholinové receptory patří mezi ligandem aktivované kanály, které se nacházejí na nervosvalové synapsi a v centrálním a periferním nervovém systému. Aktivita nikotinového receptoru může být ovlivněna řadou farmakologických látek. V této práci jsme se zaměřili na studium inhibičního účinku takrinu a jeho derivátů na nikotinové acetylcholinové receptory svalového a neuronálního typu. Tyto deriváty působí jako inhibitory acetylcholinesterázy a interagují přímo také s nikotinovými acetylcholinovými receptory. Na inhibitorech cholinesteráz je založena převážná část dnešní terapie Alzheimerovy choroby. Mechanismus účinku takrinu a jeho derivátů jsme studovali pomocí metody terčíkové zámku (patch clamp) v konfiguraci měření proudů z celé buňky. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)
|
|
|
Adenylát cyklázový toxin bakterie Bordetella pertussis, jeho konformace a iontová rovnováha v hostitelské buňce.
Motlová, Lucia ; Konopásek, Ivo (vedoucí práce) ; Krůšek, Jan (oponent)
Adenylát-cyklázový (CyaA, ACT) toxin je jedním z hlavních virulenčních faktorů bakterie Bordetella pertussis. Ačkoli se CyaA váže na mnoho typů membrán, předpokládá se, že jeho receptorem je integrin CD11b/CD18, který je exprimován na povrchu myeloidních buněk. CyaA patří do rodiny RTX toxinů-hemolyzinů. CyaA působí na hostitelské buňky dvěma na sobě nezávislými aktivitami. Jednou z nich je přeměna ATP na cyklické AMP, kterou zajišťuje adenylát-cyklázová (AC) doména po translokaci do cytozolu hostitelské buňky, při které dochází ke vstupu vápenatých kationtů do hostitelské buňky. Translokace je pravděpodobně iniciována interakcí monomeru CyaA s cílovou membránou. Druhá aktivita CyaA je tvorba kanálu, selektivního pro kationty, který může způsobit koloidně osmotickou lyzi cílových buněk. Kanálo-tvorná aktivita je zajišťována RTX hemolyzinovou doménou a předpokládá se u ní oligomerizace, i když bylo zjištěno, že únik draselných kationtů z hostitelské buňky způsobuje CyaA ve formě monomeru. Také není jasné, zda by k oligomerizaci CyaA docházelo v roztoku, nebo až po interakci s hostitelskou membránou. Cílem této práce bylo zkoumat tok sodných iontů na membráně myších makrofágů J774A.1, které na svém povrchu exprimují CD11b/CD18 integrin. Pro dosažení tohoto cíle byly použity fluorescenční metody....
|
host ::
RSS.