|
|
Vliv expozice těžkých kovů na expresi mRNA isoforem metalothioneinu u adherentních buněčných linií
Jordanová, Lucie
Metalothionein je malý protein bohatý na cystein, který hraje důležitou roli v homeostáze kovů a ochraně před toxicitou těžkých kovů, poškozením DNA a oxidačním stresem. Bakalářská práce byla provedena za účelem zjištění vlivu expozice těžkých kovů na expresi mRNA isoforem metalothioneinu u adherentních buněčných linií. Byl zkoumán vliv expozice zinku ve formě ZnSO4 na expresi mRNA isoforem MT-1A, MT-1X a MT-2A u adherentních buněčných linií rakoviny prsu MCF-7, MDA-MB-231 a T-47D. Pomocí MTT testu viability je zjištěno, jak se mění viabilita buněk při různých koncentracích ZnSO4 a pomocí denaturačního agarózového gelu je ověřena integrita RNA. Pro studium hladin mRNA je využita polymerázová řetězová reakce v kombinaci s reverzní transkripcí qRT-PCR.
|
|
|
Příprava a charakterizace cílených mRNA/DNA transfekčních nanovektorů
Horák, Tomáš ; Chmelíková, Larisa (oponent) ; Skopalík, Josef (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá genetickým inženýrstvím, zejména transfekcí DNA do MSC (Mesenchymal stromal cells) a dendritických buněk. Pro vnesení vektoru do buněk byly odzkoušeny jak lipoplexy, tak kovové magnetické nanočástice. Zkoumání bylo zaměřeno na nalezení účinnějších metod transfekce. Dle analýzy na MADLS a gelové elektroforéze byly zjištěny aspekty hrající důležitou roli při konjugaci a následné transfekci. Konjugace nastává již po 4 minutách, jak dokládá nárůst zeta-potenciálu, avšak pro dosáhnutí plné konjugace je potřeba inkubovat vzorek 20 min. Při neúplné konjugaci na železité nanočástice docházelo k výskytu silných interakcí nosič-nosič, a tím tvoření nežádoucích slepenců. Enkapsulace do lipozómů s kationickou úpravou povrchu proběhla bez komplikací. Úspěšnost exprese proteinu značeného GFP po transfekci těmito metodami byla vyčíslena na 95%, resp. 91%. Tento výsledek je připisován malé cytotoxicitě. Komerční otestované kity na dendritických buňkách však měli úspěšnost pod 5% s vysokou cytotoxicitou.
|
|
|
Charakterizace pankreatických beta-buněk po jejich stimulované proliferaci syntetickými modifikovanými mRNA
Veľasová, Adriana ; Koblas, Tomáš (vedoucí práce) ; Bořek Dohalská, Lucie (oponent)
Diabetes mellitus je chronické onemocnění způsobené ztrátou beta-buněk slinivky břišní, ke které dochází v důsledku autoimunitní destrukce, či zvýšené apoptózy beta-buněk. Nedostatek beta-buněk má za následek sníženou produkci insulinu, který hraje významnou roli v metabolismu glukosy. Počet beta-buněk organismu je jedním z hlavních faktorů, který ovlivňuje vznik tohoto chronického onemocnění. Z tohoto důvodu bylo vhodné nalézt způsob, pomocí kterého by bylo možné počet beta-buněk organismu navýšit a obnovit tak přirozenou cestou produkci insulinu bez jakékoliv nutnosti využívání insulinových infuzí. Schopnost buněčného dělení beta-buněk ovšem s věkem klesá a v dospělosti je prakticky nulová. Nadějnou cestou k obnově insulin produkující tkáně se tak jeví studium buněčného cyklu beta-buněk, především poté časných a pozdních cyklinů a cyklin dependentních kinas, které působí jako regulátory buněčného cyklu. S cílem zvýšit počet beta-buněk vstupujících do buněčného cyklu jsme se zaměřili na studium vlivu in vitro připravených (IVT) mRNA cyklinů typu D a cyklin dependentních kinas 4 a 6 na stimulaci buněčného dělení izolovaných beta-buněk. Zjistili jsme, že transfekce IVT mRNA pro cykliny typu D v kombinaci s cyklin dependentními kinasami 4 a 6 výrazně zvyšuje proliferaci beta-buněk uvězněných v klidové fázi...
|
|
|
Stimulace proliferace beta-buněk pankreatu pomocí syntetických modifikovaných mRNA kódující geny regulátorů buněčného cyklu
Ivanovská, Dana ; Koblas, Tomáš (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
je metabolické onemocnění, které se projevuje dlouhodobě zvýšenou krvi. Hyperglykémie je způsobena ztrátou pankreatických inzulín produkujících beta buněk. V případě diabetu mellitu II. typu bývá také spojena Z toho důvodu by náhrada nebo regenerace beta buněk pacientů. V současné době se vědecký výzkum zaměřuje stimulaci proliferace pankreatických beta buněk. potenciálně vhodné molekuly pro indukci proliferace beta buněk. Tyto proteiny řídí vstup buňky do buněčného cyklu. Cílem této bakalářské práce bylo ověřit možnost navození proliferace beta buněk prostřednictvím synteticky připravených mRNA cyklinů typu D syntetizovaných mRNA umožnuje krátkodobě zvýšenou expresi příslušných proteinů. Dále byly také využity mutované formy cyklinů D, které vyznačují vyšší stabilitou a tedy i delším poločasem života. Po transfekci sociovaných Langerhansových ostrůvků byla detekována přítomnost cyklinů typu D Cdk4/6 metodou nepřímé imunofluorescence. Současně byla také provedena metoda Western blotu s následnou imunodetekcí proteinů. Transfekce potkaních Langerhansových ostrůvků rů pro cykliny typu D s Cdk4/6 vedla ve všech případech k výrazné indukci proliferace potkaních beta buněk. Míra proliferace se pohybovala v rozmezí − kombinaci transfekovaných syntetických mRNA, kdežto u kontrolní netransfekovaných beta buněk byla...
|
|
|
Posttranskripční úpravy mRNA molekul u virů čeledi Poxviridae
Jakešová, Kristýna ; Vopálenský, Václav (vedoucí práce) ; Šmahel, Michal (oponent)
Posttranskripční modifikace mRNA molekul u virů čeledi Poxviridae, do které patří také virus vakcinie, mají klíčovou roli v regulaci genové exprese viru a ovlivňují také interakce viru s hostitelskou buňkou. Mezi tyto modifikace patří syntéza 7-methylguanosinové čepičky, 2'-O-methylace, polyadenylace 3' konce vlákna mRNA, hydrolýza 7-methylguanosinové čepičky a polyadenylace 5' konce mRNA vlákna. Studium posttranskripčních či kotranskripčních modifikací mRNA u virů čeledi Poxviridae může přispět k lepšímu porozumění virové patogenezi a vývoji nových strategií v léčbě infekcí způsobených viry z této čeledi. Cílem této bakalářské práce je shrnutí poznatků o kotranskripčních či posttranskripčních modifikacích mRNA molekul u virů čeledi Poxviridae se zvláštním zřetelem na virus vakcinie.
|
|
|
Příprava a charakterizace cílených mRNA/DNA transfekčních nanovektorů
Horák, Tomáš ; Chmelíková, Larisa (oponent) ; Skopalík, Josef (vedoucí práce)
Tato diplomová práce se zabývá genetickým inženýrstvím, zejména transfekcí DNA do MSC (Mesenchymal stromal cells) a dendritických buněk. Pro vnesení vektoru do buněk byly odzkoušeny jak lipoplexy, tak kovové magnetické nanočástice. Zkoumání bylo zaměřeno na nalezení účinnějších metod transfekce. Dle analýzy na MADLS a gelové elektroforéze byly zjištěny aspekty hrající důležitou roli při konjugaci a následné transfekci. Konjugace nastává již po 4 minutách, jak dokládá nárůst zeta-potenciálu, avšak pro dosáhnutí plné konjugace je potřeba inkubovat vzorek 20 min. Při neúplné konjugaci na železité nanočástice docházelo k výskytu silných interakcí nosič-nosič, a tím tvoření nežádoucích slepenců. Enkapsulace do lipozómů s kationickou úpravou povrchu proběhla bez komplikací. Úspěšnost exprese proteinu značeného GFP po transfekci těmito metodami byla vyčíslena na 95%, resp. 91%. Tento výsledek je připisován malé cytotoxicitě. Komerční otestované kity na dendritických buňkách však měli úspěšnost pod 5% s vysokou cytotoxicitou.
|
|
|
Effect of selected antineoplastic drugs on the gene expression of DNA repair proteins
Klčová, Silvia ; Jirkovská, Anna (vedoucí práce) ; Suchá, Simona (oponent)
Univerzita Karlova v Prahe, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických vied Kandidát: Bc. Silvia Klčová Školiteľ: PharmDr. Anna Jirkovská, Ph.D. Názov práce: Vplyv vybraných protinádorových liečiv na génovú expresiu proteínov účastniacich sa bunkovej odpovede na poškodenie DNA Každá jedna bunka ľudského organizmu je nepretržite vystavovaná širokému spektru stresových faktorov, konzekvenciou ktorých vznikajú poškodenia v molekule DNA. Vzniknuté zmeny predstavujú škálu alterácií - od jednoduchých alkylačných modifikácií báz až po najnepriaznivejšie dvojvláknové zlomy. Vplyv bunkového stresu a následné genotoxické poškodenie DNA je však dvojsečná zbraň. Na jednej strane môžu byť typické alterácie v genóme vyvolané vplyvom mutagénnych agens (ako napríklad zložky tabakového dymu či ionizujúce žiarenie), pričom akumuláciou dôsledkov ich pôsobenia nastane strata kontroly nad jednotlivými krokmi bunkového cyklu, čo vyústi v nádorovú transformáciu bunky. Avšak na strane druhej, navodenie detrimentálneho účinku zasahujúceho do genómu nádorových buniek je jedným zo základných prístupov cytostatickej liečby malignít. V našej práci sme sa preto zamerali na štúdium niekoľkých antineoplastických liečiv široko využívaných v klinickej praxi (etopozid, daunorubicín), či podstupujúcich klinické...
|
|
|
Charakterizace beta buněk pankreatu po jejich in vitro stimulované proliferaci syntetickými modifikovanými mRNA
Veľasová, Adriana ; Koblas, Tomáš (vedoucí práce) ; Černá, Věra (oponent)
Vznik diabetu mellitu I., či II. typu přímo souvisí s homeostázou proliferace a apop- tosu β-buněk Langerhansových ostrůvků slinivky břišní. Jakákoliv dysbalance, která vede k úbytku v množství β-buněk organismu zvyšuje pravděpodobnost vzniku to- hoto onemocnění. Pacienti trpící diabetem mellitem jsou odkázáni na částečnou, či úplnou substituci insulinu alternativními cestami, neboť jejich pankreas není scho- pen pokrýt potřeby insulinu organismu. S cílem obnovy přirozené produkce insulinu u pacientů trpících diabetem mellitem dochází k hledání optimálního způsobu, který by zajistil navýšení počtu β-buněk organismu a tím obnovil fyziologickou produkci insulinu. Velkou překážkou se v tomto ohledu jeví nízká citlivost diferencovaných β- buněk k mitogenním signálům, které by mohly zajistit vstup β-buněk do buněčného cyklu. Znovuobnovení buněčného cyklu β-buněk souvisí s G0/G1/S přechodem buněč- ného cyklu, který je pod kontrolou retinoblastomového proteinu (RB). RB musí být pro vstup do buněčného cyklu fosforylován, přičemž fosforylaci zajišťují cyklin de- pendentní kinasy 4 a 6, které asociují s cykliny rodiny D. V rámci této práce byl proto sledován vliv IVT mRNA (in vitro transkribované mRNA) na proliferaci potkaních β-buněk. Transfekce IVT mRNA pro kombinace homologů cyklinů D a cyklin de-...
|
|
|
Lokalizace maternálních RNA ve vajíčcích a časných embryích
Šimková, Kateřina ; Šindelka, Radek (vedoucí práce) ; Frolíková, Michaela (oponent)
Určení stavby tělního plánu díky asymetrickému rozložení maternálních RNA a proteinů bylo studováno u mnoha živočišných druhů. Během oogeneze si živočichové vytváří zásoby těchto RNA a proteinů, které využívají pro regulaci embryonálního vývoje, a to až do znovuzahájení transkripce z embryonálního genomu. V této diplomové práci jsem se věnovala především identifikaci asymetricky rozmístěných RNA v časných embryích obojživelníka Ambystoma mexicanum, které stojí za určením animálně-vegetativní osy. V druhé části mé práce jsem se také pokusila identifikovat asymetricky rozmístěné RNA ve 2 a 4 buněčném embryu, které by mohly stát za určením dalších tělních os - dorzo-ventrální a levo-pravé. Pomocí RT-qPCR tomografie se mi úspěšně podařilo stanovit lokalizační profil vybraných maternálních RNA podél A-V osy a v jednotlivých blastomerách 2 a 4 buněčného embrya. Dále se nám pomocí RNA-seq podařilo získat celkový obraz transkriptomu časných embryí, který nám ukázal, že se během časného vývoje odehrává řada změn. Tyto události jsem rozdělila do tří kategorií: relokalizace RNA, syntéza RNA před aktivací embryonální transkripce a degradace RNA v časném vývoji. Zajímavé zjištění bylo odhaleno ve skupině RNA degradovaných během časného vývoje, která obsahuje řadu genů, které mají u Xenopus laevis a dalších...
|
|
|
Vliv kancerogenního azobarviva Sudanu I na expresi biotransformačních enzymů
Hejduková, Žaneta ; Svášková, Dagmar (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Sudan I je poměrně hojně používaným azobarvivem, které má schopnost vyvolat tvorbu nádorů v orgánech a tkáních experimentálních zvířat. V průběhu reakcí katalyzovaných mikrosomálními monooxygenasovými enzymovými systémy nebo cytoplazmatickými derivatizačními enzymy je Sudan I oxidován na reaktivní metabolity, které se kovalentně vážou na nukleové kyseliny a způsobují jejich poškození. Sudan I může být metabolizován i redukční cestou, např. enzymem DT-diaforasou (NQO1). Redukce Sudanu I jsou považovány za reakce detoxikační. Působení Sudanu I in vivo je v této práci zkoumáno z hlediska schopnosti indukovat expresi biotransformačního enzymu DT-diaforasy ve tkáních potkanů premedikovaných daným azobarvivem. Cílem práce bylo konkrétně kvantifikovat míru indukce na úrovni mRNA. Po provedení izolace celkové RNA z orgánů potkanů premedikovaných Sudanem I byla RNA převedena na cDNA pomocí reverzní transkripce s využitím náhodných hexamerů jako primerů. Metodou "real-time" PCR s použitím specifických sond bylo kvantifikováno zastoupení mRNA pro enzym NQO1 v orgánech premedikovaných potkanů, relativně vůči kontrolnímu genu s konstantní expresí (β-aktin). Porovnáním takto stanovených množství mRNA v jednotlivých orgánech pro premedikované a nepremedikované potkany bylo zjištěno, že Sudan I vyvolal...
|
host ::
RSS.