|
|
Mutační analýza obalového proteinu X viru bramboru (PVX)
Werschallová, Markéta ; Ryšánek, Pavel (vedoucí práce) ; Jan, Jan (oponent)
Předkládaná diplomová práce se zabývá mutační analýzou konzervovaných aminokyselin obalového proteinu (CP, coat protein) X viru bramboru (PVX, Potato virus X), kterou má být zjištěna důležitost vybraných aminokyselin pro šíření viru v rostlině. Jako pokusné rostliny byly vybrány tabáky Nicotiana benthamiana. Modifikace v obalovém proteinu byly provedeny na základě porovnání aminokyselinové sekvence obalového proteinu PVX s CP viru mozaiky papáji (PapMV CP, Papaya mosaic virus coat protein), zatím jediného zástupce potexvirů, kam patří i PVX, s popsanou krystalovou strukturou obalového proteinu, u kterého byla experimentálně potvrzena důležitost určitých aminokyselin pro interakci podjednotek obalového proteinu CP,CP PapMV a CP,RNA a tím i pro tvorbu virových částic. Z databáze National Center for Biotechnology Information (NCBI) byly získány dostupné aminokyselinové sekvence izolátů a kmenů PVX CP, které byly porovnány mezi sebou, ale i se sekvencí PVX využívanou v Laboratoři virologie ÚEB, AV ČR v. v. i. Jako konzervované pozice byly určeny kodóny kódující fenylalanin a lysin v pozici 33 a 118 obalového proteinu, které byly mutovány pomocí metod molekulární biologie.
Celkem bylo vytvořeno 5 konstruktů mutantů obalového proteinu, 2 deleční mutanti N- konce PVX CP, kteří byli vytvořeni ve vektoru odvozeném od PVX (pGR106), ve kterém je integrována cDNA sekvence PVX, zbylí 3 bodoví mutanti byli vytvořeni pouze jako produkt SOE PCR. Do delečních mutantů, u nichž byla odstraněna větší část N- koncové sekvence CP, přesněji sekvence mezi 2.,32. a 2.,33. kodónem, byl zaklonován vytvořený reportérový gen GFP pro sledování nástupu signálu infekce a šíření mutantů v rostlinných pletivech. Ve výsledku se oba mutanti šířili pouze z místa agroinfiltrace do okolních buněk inokulovaného listu. Rozdíl byl zaznamenán jak v rychlosti nástupu signálu GFP, tak i v míře rozšíření mutantů do okolních buněk. Deleční mutant s ponechaným kodónem pro F33 vykazoval jednak rychlejší nástup signálu, ale byl schopen se šířit mnohem rychleji a výrazněji do okolních buněk, ale pouze v rámci inokulovaného listu, zatímco u delečního mutanta s odstraněným kodónem pro F33 byl zaznamenán pomalejší nástup signálu a menší schopnost infikovat okolní buňky. Dále byli vytvořeni bodoví mutanti, deleční a substituční, konkrétně deleční mutant kodónu F33 (delece F33), substituční mutant, u kterého byl kodón fenylalaninu v pozici 33 nahrazen kodónem alaninu (F33A) a substituční mutant, u kterého byl kodón lysinu v pozici 118 nahrazen kodónem alaninu (K118A). Bohužel se nepodařilo bodové mutanty úspěšně vložit do vektoru pGR106, tudíž nebylo možné je zhodnotit v rostlinách N. benthamiana.
Z uvedených výsledků lze usuzovat na důležitost aminokyseliny F33 při mezibuněčném pohybu v rámci sousedních buněk. Pro posouzení důležitosti F33 a K118 v systémové infekci by bylo nutné zhodnotit i bodové mutanty delece F33, F33A a K118A.
|
host ::
RSS.