|
|
Identification and characterization of flagellar tip proteins in Trypanosoma brucei
Pavlisková, Hana ; Varga, Vladimír (vedoucí práce) ; Čajánek, Lukáš (oponent) ; Hashimi, Hassan (oponent)
Distální konec eukaryotického bičíku je jednou z nejdůležitějších částí bičíku v mnoha eukaryotických buňkách. S distálním koncem bylo asociováno několik důležitých funkcí, avšak jeho proteinové složení zůstává záhadou. Hlavním cílem této dizertační práce je identifikovat a charakterizovat proteiny distálního konce eukaryotického bičíku. Využitím modelového organismu, Trypanosoma brucei, který je známý jako parazit, a TrypTag.org projektu, který má za cíl lokalizovat všechny protein-kódující geny v genomu tohoto modelového organismu, se nám podařilo identifikovat 78 proteinů, které lokalizují na distální konec bičíku T. brucei. Abychom mohli tyto kandidátní proteiny charakterizovat, bylo nutné zavést v naší laboratoři nové přístupy. Za prvé jsme vyvinuli protilátkové markery, které označují distální konec nově vznikajícího bičíku, přesněji konektor spojující bičíky. Za druhé jsme vyvinuli rychlý přístup bez klonování pro značení a inducibilní overexpresi trypanozomálních proteinů. Prokázali jsme, že tento přístup je vhodný jak pro overexpresi velkých proteinů, tak i proteinů distálního konce bičíku. To umožňuje studium fenotypů při overexpresi proteinů a generuje materiál pro purifikaci proteinů pro následnou biochemickou charakterizaci. Za třetí jsme optimalizovali ultra-expanzní mikroskopii,...
|
|
|
The influence of the RACK1 scaffold protein and the ERK signalling pathway on cell polarity
Klímová, Zuzana ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Brábek, Jan (oponent) ; Varga, Vladimír (oponent)
Ustanovení buněčné polarity je základním předpokladem pro buněčnou migraci, protože poskytuje buňce informace o směru následné migrace. Jde o vysoce dynamický proces, který vede k asymetrickému rozdělení cytoskeletálních struktur, buněčných organel, proteinových komplexů a signálních drah, což se odráží v typickém polarizovaném tvaru buňky. Tvar buňky je určen společným působením dynamiky aktinového cytoskeletu, buněčných adhezí a buněčné membrány ve vztahu k extracelulárnímu povrchu. Adheze buněk na extracelulární matrix je morfogenetický proces, při kterém buňky zpočátku izotropně rozšiřují adhezivní plochu od místa počáteční adheze. V následné fázi pak adherující buňky spontánně ztrácejí radiální symetrii a zaujímají migrační symetrii s prostorově oddělenou protrusivní přední a retrahující zadní částí buňky. Není však jasné, jak k narušení radiální symetrie dochází a jak je tento proces organizován a regulován. V této práci ukazuji, že narušení radiální symetrie u adherujících fibroblastů začíná vytvořením statické a dále se nerozšiřující zadní části buňky, která je ohraničená velkými, ale málo četnými fokálnímiadhezemi. Adaptorový či "scaffold" protein RACK1 je pak klíčový pro vznik těchto statických a neprotrusivních oblastí. RACK1 usnadňuje aktivaci ERK2 v závislosti na signálu z buněčných...
|
|
|
Molecular mechanisms of the assembly and function of BBSome
Prasai, Avishek ; Huranová, Martina (vedoucí práce) ; Varga, Vladimír (oponent) ; Bosáková, Michaela (oponent)
Bardetův Biedlův syndrom (BBS) je genetická porucha způsobená dysfunkcí BBSomu, což je oktamerický adaptorový proteinový komplex. BBSome transportuje signální receptory dovnitř a ven z cílií, což jsou senzorické buněčné organely vystavěné na V první části práce jsme se zaměřili na objasnění formování BBSomu v živých buňkách. Vytvořili jsme knihovnu lidských a myších buněčných linií, kterým chyběly jednotlivé podjednotky BBSomu a vnesli jsme do nich ostatní podjednotky označené YFP proteinem. K analýze jednotlivých kroků formování BBSomu jsme použili biochemické testy, imunofluorescenci a kvantitativní fluorescenční mikroskopii. Odhalili jsme, že sestavování BBSomu probíhá postupně v různých částech buňky. Ukázali jsme, že BBS4 iniciuje rních satelitech. Přemístění pre bázi a finální zkompletování BBSomu umožňuje BBS1. Odhalili jsme také, že v buňkách, kde chybí BBS12 chaperonin, se formuje malá část BBSomu a/nebo subkomplexů . To naznačuje, že BBS chaperoniny zajištují Ciliární ektocytóza odstraňuje přebytečné ciliární signální receptory prostřednictvím odštěpení apikální části ciliární membrány, což je regulované polymerizací aktinu. Faktory které spouštějí polymerizaci aktinu v místě ektocytózy, zůstávají neznámé. Ve druhé části práce jsme odhalili, že CDC42, člen rodiny RHO GTPáz, spouští polymerizaci...
|
|
|
Intermediate filament proteins of Preaxostyla flagellates
Švagr, Ezra ; Hampl, Vladimír (vedoucí práce) ; Varga, Vladimír (oponent)
6 Abstrakt Monocercomonoides exilis a Paratrimastix pyriformis jsou protista ze skupiny Preaxostyla (Excavata), mají exkavátní morfologii, která se považuje za ancestrální formu cytoskeletální organizace eukaryotických buněk. Podstatnou částí této morfologie jsou vlákna složená z dosud neidentifikovaných proteinů. Tato práce staví na teorii, že tyto vlákna jsou složena z proteinů Intermediárních filament (IF proteinů). IF proteiny jsou polyfyletická skupina proteinů, která se podílí na tvorbě mechano-elasticky významných vláken v eukaryotických buňkách. Nejvíce rozšířenou skupinou těchto proteinů jsou SF-assembliny, homology těchto proteinů byly poprvé popsány u druhu Chlamydomonas reinhardii, giardiny, proteinová rodina poprvé popsaná u Giardia intestinalis, jsou také příbuzné s těmito proteiny. Identifikace SF-assemblinů e u M. exilis a P. pyriformis by dále upevnila pozici SF-assemblinů jako obecně přítomného proteinu v eukaryotickém cytoskeletu. Cílem této práce bylo studovat proteiny přítomné v cytoskeletu exkavát dvěma způsoby. Zaprvé identifikovat proteiny v obohacené cytoskeletální frakci získané z kultur M. exilis a P. pyriformis. Zadruhé, lokalizovat SF-assembliny v obou protistech pomocí protilátek a expanzní mikroskopie. Protokol pro expanzní mikroskopii byl optimalizován pro oba organismy. V...
|
|
|
Identification and characterization of ciliary tip proteins
Gorilák, Peter ; Varga, Vladimír (vedoucí práce) ; Lánský, Zdeněk (oponent) ; Dean, Samuel (oponent)
Distální konec řasinky/bičíku, také známý jako doména ciliární špičky (CTD), je nepostradatelná pro strukturu a funkci eukaryotických řasinek. Lepšímu porozumění této domény brání nedostatečné znalosti jejích proteinových komponentů. Cílem dizertační práce bylo ověřit lokalizaci vybraných známých proteinů CTD savčích řasinek, a testovat lokalizaci kandidátních CTD proteinů, jejichž ortology se nacházejí na špičce bičíku evolučne vzdáleného prvoka Trypanosoma brucei. Pomocí našeho lokalizačního postupu jsme identifikovali dva proteiny, které výrazně lokalizují do CTD primární řasinky. Jeden z těchto proteinů, ZC2HC1C, navíc také lokalizuje do stacionárních bodů podél axonemy, jejichž pozice se shodují s místy zastavení a otáčení intraflagelárních vlaků. Předpokládáme, že se může jednat o konce sub-distálně končících axonemalních mikrotubulů. Dále prokazujeme, že protein ULK4 lokalizuje do CTD pohyblivých ependymálních řasinek, ale ne do CTD primárnich řasinek, což je v souladu s dříve publikovanými fenotypy u ULK4 knock- outových myší a dokládá rozdíly ve složení CTD těchto dvou typů řasinek. Nakonec jsme ukázali, že Expanzní mikroskopie je rychlá a robustní super-rezoluční metoda, vhodná pro ultrastrukturální a lokalizační studie CTD savčích řasinek a bičíků T. brucei.
|
|
|
Stability of protein complexes in the cytoskeleton of the eukaryotic flagellum
Pružincová, Martina ; Varga, Vladimír (vedoucí práce) ; Čajánek, Lukáš (oponent)
Cília/bičík je komplexná organela vystupujúca z tela bunky, ktorá môže mať niekoľko funkcií, ako napríklad pohybovú, senzorickú alebo signálnu. Bičík je zostavený zo stoviek proteínov, ktorých väčšina tvorí kostru - mikrotubulárnu axonému. Pretože bičík neobsahuje ribozómy, proteíny, ktoré sa podieľajú na jeho stavbe a funkcii, musia byť dovážané z tela bunky a inkorporované na správne pozície. Navyše, tieto proteíny si musia zachovávať svoju funkciu počas dlhého obdobia, a to napriek tomu, že sú vystavené mechanickému a environmentálnemu stresu. Tieto skutočnosti vzbudzujú otázku, či a kde dochádza v bičíku k výmene proteínov. Predchádzajúce štúdie bičíkov na Chlamydomonas reinhardtii prezentovali, že bičík je dynamická štruktúra (Marshall & Rosenbaum, 2001). Naopak, štúdie na Trypanosoma brucei ukázali, že bičíky tohto organizmu sú pozoruhodne stabilné (Vincensini et al., 2018). Avšak to, akým spôsobom sa bičík vytvára a stabilizuje, bolo doteraz skúmané iba na veľmi malom počte proteínov a iba v krátkych časových intervaloch. Navyše, tieto experimenty využívali expresiu študovaných proteínov s neprirodzenými regulačnými mechanizmami. Na objasnenie detailov spôsobu fungovania proteínovej obmeny v bičíku bola v tejto práci použitá T. brucei. Jedným z dôvodov výberu tohto modelového organizmu bolo...
|
|
|
Jednohostitelská trypanosomatida bezobratlých
Havlová, Jolana ; Votýpka, Jan (vedoucí práce) ; Varga, Vladimír (oponent)
T ída Kinetoplastea zahrnuje voln žijící i parazitické zástupce. Jednou z nejznám jších skupin je ád Trypanosomatida, do kterého pat í obligátní parazité (Trypanosoma, Leishmania) širokého spektra hostitel . Mnohé druhy jsou velmi nebezpe nými patogeny lov ka, jiné p sobí velké ekonomické ztráty v zem d lství. Nicmén p evážná ást trypanosomatid pat í mezi jednohostitelské parazity hmyzu, kte í jsou pro své hostitele v tšinou nepatogenní. Jednohostitelská trypanosomatida parazitují p evážn v ádech polok ídlých a dvouk ídlých. P edložená diplomová práce se v nuje detekci nákaz jednohostitelskými trypanosomatidy u šváb odchycených na území eské republiky a šváb pocházejících z n kolika r zných chov . Švábi jsou vhodní mechani tí p enaše i r zných patogen (v etn parazit ), kte í ohrožují zdraví lov ka i zví at. První popis trypanosomatid ve švábech byl zdokumentován již na po átku 20. století, ale žádná studie se t mto nález m d kladn ji nev novala. Cílem této práce byla i podrobná morfologická a ultramikroskopická analýza a studium hostitelské specifity nedávno popsaného druhu švábí herpetomonády Herpetomonas tarakana. Tato diplomová práce byla áste n podkladem již publikovaného lánku "Diversity of trypanosomatids in cockroaches and the description of Herpetomonas tarakana sp. n.", na který navazuje a...
|
|
|
Searching for microtubule inner proteins
Bočan, Václav ; Libusová, Lenka (vedoucí práce) ; Varga, Vladimír (oponent)
Diplomová práce Pátrání po vnitřních proteinech mikrotubulů Bc. Václav Bočan Abstrakt Mikrotubuly - válcovité polymery α- a β-tubulinu - vykonávají v eukaryotických buňkách řadu nezastupi- telných funkcí. Jelikož jsou zapojeny do mnoha buněčných dějů, jejich posttranslační modifikace, rychlost polymerizace a interaktom musí být pečlivě regulovány. V nedávné době byl objeven nový způsob inter- akce proteinů s mikrotubuly, a to v podobě vnitřních mikrotubulárních proteinů, které vstupují přímo do lumen mikrotubulů. O vnitřních proteinech dynamických mikrotubulů v cytoplasmě je známo velmi málo. Zatím byly objeveny pouze dva: αTAT1 a MAP6. Stabilizované mikrotubuly, jako například ty v axonemě bičíku, obsahují de- sítky pravidelně uspořádaných vnitřních mikrotubulárních proteinů, přičemž jsou stále objevovány nové. Pravděpodobně hrají úlohu pro výstavbu axonemy a její zpevnění, což je nezbytné pro odolávání mecha- nickým silám vytvářeným v bičíku při pohybu. Tato diplomová práce přispívá k poznání vnitřních mikrotubulárních proteinů, a to jak v dynamických, tak v axonemálních mikrotubulech. Ve své první části se práce věnuje hledání nových vnitřních proteinů uv- nitř dynamických mikrotubulů. K dosažení tohoto cíle jsou využity dva nezávislé přístupy - značení souse- dících proteinů pomocí nespecifické biotin...
|
|
|
Regulation of microtubule dynamics revealed by single-molecule TIRF and IRM microscopy
Zhernov, Ilia ; Lánský, Zdeněk (vedoucí práce) ; Cifra, Michal (oponent) ; Varga, Vladimír (oponent)
Mikrotubulární cytoskelet je rozmanitá bio-polymerní síť nezbytná pro život všech eukaryotních buněk. Mikrotubuly stochasticky přechází mezi fázemi polymerace a depolymerace. Tato dynamika je využívána buňkami ke generování sil nezbytných pro základní buněčné procesy, jako například buněčné dělení, motilita nebo morfogeneze. Regulace mikrotubulární dynamiky umožňuje buňkám adaptivně reagovat na změny podmínek. Molekulární mechanismy této regulace však nejsou zcela objasněny. V této práci jsme rekonstituovali dva mikrotubulární systémy, které jsme prozkoumali a popsali za použití kombinace TIRF mikroskopie s rozlišením na úrovni jedné molekuly a interferenční reflekční mikroskopie. (i) Zdvojené mikrotubuly, složené z kompletního mikrotubulu A s přisedlým mikrotubulem B, zajišťují strukturní stabilitu buněčných řasinek. I přes jejich fundamentální úlohu, není zatím znám molekulární mechanismus jejich formování. V této práci ukazujeme inhibiční roli C-terminální části tubulinu během tvorby zdvojených mikrotubulů. Zdvojené mikrotubuly jsme rekonstituovali pomocí částečného enzymatického štěpení mikrotubulů, následovaného přidáním volného tubulinu za přítomnosti stabilizačního činidla, čímž jsme objasnili dynamiku jejich vzniku. Ukázali jsme tedy, že inherentní vlastnosti tubulinu poskytují dostatečnou...
|
|
|
Stability of protein complexes in the cytoskeleton of the eukaryotic flagellum
Pružincová, Martina ; Varga, Vladimír (vedoucí práce) ; Čajánek, Lukáš (oponent)
Cília/bičík je komplexná organela vystupujúca z tela bunky, ktorá môže mať niekoľko funkcií, ako napríklad pohybovú, senzorickú alebo signálnu. Bičík je zostavený zo stoviek proteínov, ktorých väčšina tvorí kostru - mikrotubulárnu axonému. Pretože bičík neobsahuje ribozómy, proteíny, ktoré sa podieľajú na jeho stavbe a funkcii, musia byť dovážané z tela bunky a inkorporované na správne pozície. Navyše, tieto proteíny si musia zachovávať svoju funkciu počas dlhého obdobia, a to napriek tomu, že sú vystavené mechanickému a environmentálnemu stresu. Tieto skutočnosti vzbudzujú otázku, či a kde dochádza v bičíku k výmene proteínov. Predchádzajúce štúdie bičíkov na Chlamydomonas reinhardtii prezentovali, že bičík je dynamická štruktúra (Marshall & Rosenbaum, 2001). Naopak, štúdie na Trypanosoma brucei ukázali, že bičíky tohto organizmu sú pozoruhodne stabilné (Vincensini et al., 2018). Avšak to, akým spôsobom sa bičík vytvára a stabilizuje, bolo doteraz skúmané iba na veľmi malom počte proteínov a iba v krátkych časových intervaloch. Navyše, tieto experimenty využívali expresiu študovaných proteínov s neprirodzenými regulačnými mechanizmami. Na objasnenie detailov spôsobu fungovania proteínovej obmeny v bičíku bola v tejto práci použitá T. brucei. Jedným z dôvodov výberu tohto modelového organizmu bolo...
|
host ::
RSS.