|
|
Mechanismus přenosu signálu v modelovém zástupci prokaryotních hemových senzorů kyslíku
Smrčka, Tomáš ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Stráňava, Martin (oponent)
Dvou-komponentní systém, sestávající se z histidin kinasy a responzivního regulátoru, je nezbytnou molekulárně biologickou výbavou mnoha bakterií, pomocí níž je bakterie schopna reagovat na změny v prostředí. Důležitým krokem při aktivaci dvou- komponentního systému je autofosforylační reakce na dimerní histidin kinase, při které na tomto proteinu dochází k přenosu fosfátové skupiny z ATP v katalytické doméně na konzervovanou molekulu histidinu. Podle toho, zda dochází k přenosu fosfátové skupiny v rámci jedné podjednotky dimeru nebo z jedné podjednotky na druhou podjednotku rozlišujeme cis-, respektive trans-autofosforylaci. Předkládaná diplomová práce si ke studiu autofosforylační reakce zvolila histidin kinasu s globinovou doménou z půdní bakterie Anaeromyxobacter sp. Fw109-5 (AfGcHK), která využívá hemu k detekci plynných molekul. Užitím fosforylační analýzy heterodimeru AfGcHK složeného z podjednotky s defektním místem pro vazbu ATP a podjednotky se zaměněným fosforylovatelným histidinem za alanin byl pro AfGcHK identifikován trans- mechanismus autofosforylace. Klíčová slova: dvousložkové signální systémy, histidinkinasa, hemové senzory kyslíku, Phos-tag, AfGcHK
|
|
|
Využití kyselých proteáz z láčkovek pro účely vodík/deuteriové výměny.
Darebná, Petra ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Stráňava, Martin (oponent)
Využití kyselých proteáz z láčkovek pro účely vodík/deuteriové výměny Petra Darebná (Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze, Česká republika) Láčkovky (Nepenthes), vyskytující se převážně na Borneu a Sumatře, jsou jedny z mála masožravých rostlin produkujících si své vlastní proteolytické enzymy (nepenthesin I a nepenthesin II), zajišťující rostlině náhradní zdroj dusíku a dalších živin v případě růstu na půdách tyto živiny postrádajících. Tyto aspartátové proteázy jsou schopné proteolýzy při nízkém pH, které je ustaveno v trávicí láčkové tekutině po odchytu hmyzu a ve spolupráci s dalšími proteiny se účastní digesce kořisti. Předkládaná práce se zabývá zpracováním trávicí tekutiny, izolované z láček masožravých rostlin rodu Nepenthes a jejím možným použitím jako nástroje při studiu proteinů pomocí vodík/deuteriové výměny. Izoláty trávicích tekutin byly očištěny od hrubých nečistot centrifugací, aktivovány okyselením a ultrafiltračně koncentrovány. U získaných preparátů byl sledován obsah proteinů, jejich proteinový profil a byla u nich enzymatickou esejí stanovena aktivita kyselých proteáz. Následně byly u preparátů na modelových proteinech pomocí hmotnostní spektrometrie s kapalinovou chromatografií studovány preference štěpení za podmínek vhodných pro experimenty...
|
|
| |
|
|
Heterologní exprese NADPH:cytochrom P450 reduktasy
Stráňava, Martin ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
NADPH:cytochrom P450 reduktasa (CPR) je flavoprotein o velikosti 78 kDa, který je spolu s cytochromy P450 součástí monooxygenasového systému vázaného v membráně endoplasmatického retikula. Monooxygenasový systém se účastní metabolizmu široké škály organických látek, včetně léčiv nebo různých polutantů přítomných v životním prostředí (polycyklické aromatické uhlovodíky, aromatické aminy aj.). CPR funguje jako přenašeč redukčních ekvivalentů z NADPH na příslušné cytochromy P450. Pro správnou interakci s cytochromy P450 je důležitá N-terminální hydrofobní doména kotvící protein v membráně. Odstranění této domény, např. trypsinovou proteolýzou, má za následek vznik solubilní CPR (72 kDa) a ztrátu katalytické aktivity vůči cytochromu P450. V průběhu heterologní exprese v bakteriích E. coli je proteolyticky labilní místo CPR (Lys56 - Ile57) cílem působení intracelulárních proteas s trypsinovou aktivitou, což může negativně ovlivnit výtěžky nativního 78 kDa proteinu. Předkládaná diplomová práce popisuje heterologní expresi, purifikaci a charakterizaci dvou forem potkaní CPR. Forma wtCPR představuje protein přirozeně se vyskytující v potkaním organismu (kmen Wistar), zatímco mCPR obsahuje aminokyselinovou substituci (K56Q) v místě proteolytické degradace. Výsledkem zmíněné substituce je proteolyticky...
|
|
|
Příprava a základní charakterizace eukaryotického iniciačního faktoru 2α a jeho hemem regulované kinasy
Ovad, Tomáš ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Stráňava, Martin (oponent)
Hemové senzorové proteiny se podílejí na řadě významných funkcí v prokaryotických i eukaryotických organismech. Příkladem eukaryotického hemového senzorového proteinu je hemem regulovaný inhibitor (HRI), který katalyzuje fosforylaci α-podjednotky eukaryotického iniciačního faktoru 2 (eIF2α). V rámci této bakalářské práce byl nejprve amplifikován plasmid pET-21c(+)/eIF2α a jeho vhodnost pro expresi proteinu eIF2α byla ověřena pomocí dvou nezávislých metod. Následně byly připraveny proteiny HRI a eIF2α rekombinantní expresí v buňkách E. coli BL-21(DE3) transformovaných plasmidem pET-21c(+)/eIF2α, resp. HRI. Oba proteiny byly z buněčných preparátů izolovány a purifikovány pomocí afinitní a gelové permeační chromatografie. Protein eIF2α byl získán v dostatečně vysokém výtěžku (560 μg z 1 l TB média) i čistotě (90 %). Nižšího výtěžku (25 μg z 1 l TB média) i čistoty (20 %) bylo dosaženo v případě proteinu HRI, autenticita získaného preparátu byla nicméně potvrzena spektrofotometrickou charakterizací a ověřením jeho enzymové aktivity. V rámci pilotních experimentů bylo dálo zjištěno, že GTP může nahradit ATP při fosforylaci eIF2α, zatímco UTP a CTP nikoli.
|
|
|
Preparation of a plasmid, its expression and preliminary isolation of MafK protein - the interacting partner of heme sensor Bach1
Mihalčin, Peter ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Stráňava, Martin (oponent)
Bakalárska práca Abstrakt Senzorové proteíny detekujúce hem sú skupina hemoproteínov, ktorým slúži hem ako signálna molekula. Asociácia alebo disociácia hemu a hem-detekujúceho senzorového proteínu má vplyv na reguláciu mnohých fyziologických procesov riadených týmito proteínmi. Príkladom je regulácia enzýmovej aktivity alebo génovej expresie. Predkladaná bakalárska práca sa zaoberá hemovým senzorovým proteínom Bach1 a jeho interakčným partnerom, transkripčným faktorom MafK. Bach1 patrí do skupiny transkripčných faktorov s represívnymi účinkami. Cieľovými génmi, ktoré Bach1 reguluje, sú gény enzýmu hemoxygenáza, ktorá riadi degradáciu voľného hemu v bunkách. Bach1 interaguje s nadbytkom voľného hemu v bunke. Táto interakcia inaktivuje represívny účinok Bach1 a v konečnom dôsledku je v prípade nadbytku voľného hemu hemoxygenáza exprimovaná. V medziach fyziologickej koncentrácie hemu v bunkách proteín Bach1 s hemom neinteraguje a väzbou na regulačné oblasti cieľových génov inhibuje ich expresiu. Bach1 sa dokáže viazať na DNA iba v kooperácii so svojim interakčným partnerom, transkripčným faktorom MafK. Teoretickú časť tejto bakalárskej práce tvorí zhrnutie doterajších poznatkov o transkripčných faktoroch Bach1, MafK, ich vzájomnej interakcii a väzbe na DNA ako aj neodmysliteľný vplyv hemu na ich spoločnú...
|
|
|
Mechanismus přenosu signálu hemovými senzorovými proteiny detekujícími kyslík
Stráňava, Martin ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Obšil, Tomáš (oponent) ; Macek, Tomáš (oponent)
CZ Hemové senzorové proteiny, které detekují plynné molekuly, hrají v bakteriální fyziologii důležitou roli v regulaci mnoha procesů jako je např. buněčná diferenciace, virulence, tvorba biofilmu nebo mezibuněčná komunikace. Jejich struktura se vyznačuje typickou modulární architekturou, kde různé senzorové domény (nejčastěji na N-konci) regulují aktivitu katalytických neboli funkčních domén (nejčastěji na C-konci). V této disertační práci jsme se zaměřili na studium tří zástupců ze skupiny senzorových proteinů detekujících kyslík a to histidinkinasy AfGcHK, diguanylátcyklasy YddV, fosfodiesterasy EcDOS a dále na studium proteinu RR, který je interakčním partnerem AfGcHK. Hlavním cílem disertační práce bylo prostudovat intraproteinový/interdoménový přenos signálu u dvou zástupců hemových senzorových proteinů s globinovým uspořádáním senzorové domény (AfGcHK, YddV) a u jednoho zástupce s PAS uspořádáním senzorové domény (EcDOS). Dalším cílem bylo popsat interproteinový přenos signálu u dvousložkového systému AfGcHK-RR a strukturně charakterizovat tyto dva interakční partnery. Důraz byl kladen také na studium interakce modelových senzorových domén s různými signálními molekulami a popis funkce jednotlivých aminokyselin účastnících se vazby těchto signálních molekul. Studiem...
|
|
|
Využití kyselých proteáz z láčkovek pro účely vodík/deuteriové výměny.
Darebná, Petra ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Stráňava, Martin (oponent)
Využití kyselých proteáz z láčkovek pro účely vodík/deuteriové výměny Petra Darebná (Katedra biochemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova v Praze, Česká republika) Láčkovky (Nepenthes), vyskytující se převážně na Borneu a Sumatře, jsou jedny z mála masožravých rostlin produkujících si své vlastní proteolytické enzymy (nepenthesin I a nepenthesin II), zajišťující rostlině náhradní zdroj dusíku a dalších živin v případě růstu na půdách tyto živiny postrádajících. Tyto aspartátové proteázy jsou schopné proteolýzy při nízkém pH, které je ustaveno v trávicí láčkové tekutině po odchytu hmyzu a ve spolupráci s dalšími proteiny se účastní digesce kořisti. Předkládaná práce se zabývá zpracováním trávicí tekutiny, izolované z láček masožravých rostlin rodu Nepenthes a jejím možným použitím jako nástroje při studiu proteinů pomocí vodík/deuteriové výměny. Izoláty trávicích tekutin byly očištěny od hrubých nečistot centrifugací, aktivovány okyselením a ultrafiltračně koncentrovány. U získaných preparátů byl sledován obsah proteinů, jejich proteinový profil a byla u nich enzymatickou esejí stanovena aktivita kyselých proteáz. Následně byly u preparátů na modelových proteinech pomocí hmotnostní spektrometrie s kapalinovou chromatografií studovány preference štěpení za podmínek vhodných pro experimenty...
|
|
|
Heterologní exprese NADPH:cytochrom P450 reduktasy
Stráňava, Martin ; Černá, Věra (vedoucí práce) ; Martínek, Václav (oponent)
NADPH:cytochrom P450 reduktasa (CPR) je flavoprotein o velikosti 78 kDa, který je spolu s cytochromy P450 součástí monooxygenasového systému vázaného v membráně endoplasmatického retikula. Monooxygenasový systém se účastní metabolizmu široké škály organických látek, včetně léčiv nebo různých polutantů přítomných v životním prostředí (polycyklické aromatické uhlovodíky, aromatické aminy aj.). CPR funguje jako přenašeč redukčních ekvivalentů z NADPH na příslušné cytochromy P450. Pro správnou interakci s cytochromy P450 je důležitá N-terminální hydrofobní doména kotvící protein v membráně. Odstranění této domény, např. trypsinovou proteolýzou, má za následek vznik solubilní CPR (72 kDa) a ztrátu katalytické aktivity vůči cytochromu P450. V průběhu heterologní exprese v bakteriích E. coli je proteolyticky labilní místo CPR (Lys56 - Ile57) cílem působení intracelulárních proteas s trypsinovou aktivitou, což může negativně ovlivnit výtěžky nativního 78 kDa proteinu. Předkládaná diplomová práce popisuje heterologní expresi, purifikaci a charakterizaci dvou forem potkaní CPR. Forma wtCPR představuje protein přirozeně se vyskytující v potkaním organismu (kmen Wistar), zatímco mCPR obsahuje aminokyselinovou substituci (K56Q) v místě proteolytické degradace. Výsledkem zmíněné substituce je proteolyticky...
|
|
| |
host ::
RSS.