|
|
Studium produkce polyhydroxyalkanoátů pomocí vybraných termofilních zástupců rodu Aneurinibacillus
Řeháková, Veronika ; Kovalčík, Adriána (oponent) ; Pernicová, Iva (vedoucí práce)
Předmětem diplomové práce je produkce PHA kopolymerů termofilními gram-pozitivními bakteriemi rodu Aneurinibacillus. Teoretická část je věnována obecné charakterizaci PHA materiálů, jejich vlastnostem, využití a také produkci PHA polymerů bakteriemi. Experimentální část práce se zabývá produkcí PHA kopolymerů pomocí vybraných termofilních bakterií rodu Aneurinibacillus. Nejprve byla stanovena specifická enzymová aktivita PHA syntáz a poté byl proveden screening produkce PHA kopolymerů za využití vybraných laktonů (-valerolakton, -hexalakton, -valerolakton) a diolů (1,6-hexandiol, 2,3-butandiol a 1,4-butandiol). Tyto experimenty byly provedeny se šesti termofilními bakteriemi rodu Aneurinibacillus, které byly izolovány z kompostů a aktivovaných kalů. Testované kultury prokázaly schopnost inkorporace zajímavých monomerů do struktury PHA, mezi které patří 4-hydroxyvalerát (obsah dosahoval až 69,3 % celkového množství PHA), 5-hydroxyvalerát (až 47,1 %) nebo 4-hydroxyhexanoát (až 31,9 %). Následně byla pro vybrané bakteriální producenty realizována bližší charakterizace získaných PHA materiálů pomocí některých charakterizačních metod (DSC, SEC-MALS, FT-IR). Závěr experimentální části práce je věnován screeningu produkce PHA kopolymerů v laboratorních bioreaktorech pro nejspolehlivější producenty.
|
|
|
Studium produkce 3D bakteriální celulózy za využití banánových slupek jako uhlíkového zdroje
Netopilík, Tibor ; Pernicová, Iva (oponent) ; Kovalčík, Adriána (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá studiem produkce 3D bakteriální celulózy pomocí bakterie Komagataeibacter xylinus za využití banánových slupek jako zdroje uhlíku. V teoretické části se zabývá porovnáním vlastností bakteriální celulózy a rostlinné celulózy, různými způsoby biotechnologické produkce bakteriální celulózy a jejím využitím. Cílem bakalářské práce bylo zjistit, zda je možné použít banánové slupky jako uhlíkový zdroj pro biotechnologickou produkci bakteriální celulózy. Banánové slupky jsou odpadním lignocelulozóvým materiálem vznikajícím například při výrobě přesnídávek anebo ovocných případně mléčných nápojů v potravinářském průmyslu. HPLC analýza ukázala, že 1 l hydrolyzátu po enzymatické hydrolýze 100 g suchých banánových slupek na 1 l vody obsahoval 8,86 g glukózy a 10,46 g fruktózy. Hydrolyzát byl použitý jako uhlíkový zdroj pro statickou a dynamickou kultivaci bakterie Komagataeibacter xylinus. Výtěžky bakteriální celulózy získané produkcí na hydrolyzátu byly porovnané s produkcí za použití glukózy. Zjistilo se, že použití hydrolyzátu příznivě ovlivnilo výtěžky o 170 % v případě statické kultivace a o 220 % v případě dynamické kultivace. Morfologická analýza pomocí SEM potvrdila rozdíly mezi bakteriální celulózou produkovanou staticky a dynamicky. Vliv druhu uhlíkového zdroje na morfologii bakteriální celulózy byl též patrný.
|
|
|
Využití bakterie Tepidimonas taiwanensis k produkci polyhydroxyalkanoátů na odpadních substrátech
Vidláková, Michaela ; Pernicová, Iva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Předložená diplomová práce je zaměřena na screening produkce PHA pomocí termofilní bakterie Tepidimonas taiwanensis a na studium možného využití hroznových výlisků, melasy a odpadního papíru jako levných uhlíkatých substrátů pro kultivace charakterizované bakterie. Nejprve bylo provedeno testování základních kultivačních parametrů zahrnujících koncentraci uhlíkatého substrátu, dostupnost kyslíku, schopnost utilizace zdrojů dusíku a vybraných disacharidů. Produkce PHA z odpadních substrátů byla testována třemi způsoby. Při prvním byly jako zdroj uhlíku použity předem připravené hydrolyzáty z odpadních surovin zbavené pevného podílu. Druhý a třetí postup byl proveden nadávkováním odpadních materiálů přímo do minerálních médií, která se lišila pouze přítomností a absencí enzymového preparátu umožňujícím enzymatickou hydrolýzu dané suroviny za vzniku fermentovatelných sacharidů. Nejintenzivnější nárůst kultury a nejvyšší produkce PHA byla zaznamenána na hydrolyzátu z hroznových výlisků. Koncentrace biomasy u tohoto vzorku dosahovala až 4,8 g/l s obsahem 59 % PHA. Přídavek hroznových výlisků přímo do produkčního média se naopak vůbec neosvědčil, což bylo pravděpodobně způsobeno přítomností velkého množství inhibičních látek z výlisků. Podobně tomu bylo i u melasy a odpadního papíru, kdy byla bakterie Tepidimonas taiwanensis schopna růstu a případné produkce PHA pouze v malé míře. V rámci práce se podařilo také charakterizovat vliv teploty a pH na aktivitu enzymového koktejlu Viscozyme L a určit teplotní a pH optimum PHA syntázy bakteriálního kmene Tepidimonas taiwanensis v buněčném lyzátu.
|
|
|
Identifikace a izolace PHA produkujících bakterií
Pernicová, Iva ; Ondrejovič, Miroslav (oponent) ; Rychtera, Mojmír (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Polyhydroxyalkanoáty (PHA) jsou mikrobiální zásobní polyestery, které mohou představovat obnovitelnou a ekologicky šetrnou alternativu k petrochemickým plastům. Jejich výroba a využití jsou do velké míry znevýhodněny vysokou produkční cenou. Jednou z možností, jak snížit cenu produkce PHA, je využití extrémofilních PHA producentů, které s sebou přináší především výhody vyplývající z vysoké robustnosti procesu vůči mikrobiální kontaminaci. V předložené práci byla pozornost zaměřena na studium produkce PHA pomocí vybraných halofilních a termofilních mikroorganismů. Z halofilních mikroorganismů byly testováni především vybraní sbírkoví zástupci rodu Halomonas, a to vzhledem k jejich možnému využití k produkci PHA z levného odpadního fritovacího oleje. Byli identifikováni dva slibní PHA producenti, a to konkrétně Halomonas hydrothermalis a Halomonas neptunia. Oba kmeny dosahovaly v rámci baňkových experimentů solidních výtěžků PHA a při přídavku vhodných strukturních prekurzorů byly také schopny produkce kopolymerů se zajímavými materiálovými vlastnostmi. Hlavní důraz byl však v práci kladen na studium produkce PHA pomocí termofilních mikroorganismů. V rámci práce byla provedena izolace termofilních PHA producentů z různých termofilních konsorcií (aktivní kal, kompost atd.). V průběhu izolačních experimentů byl navržen originální izolační postup využívající změny osmotického tlaku tzv. osmoselekce. Touto originální cestou bylo získáno několik desítek slibných termofilních producentů PHA, kteří byli taxonomicky zařazeni pomocí sekvenace genu 16S rRNA a byl u nich testován PHA produkční potenciál. Nejslibnějším PHA producentem byl izolát klasifikovaný jako Aneurinibacillus sp. H1. K produkci PHA pomocí Aneurinibacillus sp. H1 lze využít řadu substrátů včetně odpadního glycerolu. Ještě významnější je schopnost syntetizovat kopolymery s vysokým obsahem 4-hydroxybutyrátu. Monomerní složení PHA kopolymeru, a tím i materiálové vlastnosti připraveného kopolymeru, je možné kontrolovat vhodným nastavením kultivačních podmínek. Připravený kopolymer P(3HB-co-4HB) má unikátní vlastnosti a velký aplikační potenciál v řadě high-end aplikací například v oblasti péče o zdraví, potravinářství nebo kosmetice.
|
|
|
Aflatoxiny v potravinách a jejich vliv na DNA a buněčné linie
Šislerová, Lucie ; Pernicová, Iva (oponent) ; Brázda, Václav (vedoucí práce)
Aflatoxiny představují kvůli jejich vysoké toxicitě a karcinogenitě velké nebezpečí, kterému se v běžném životě snadno nevyhneme. Intoxikace aflatoxiny způsobuje velkou řadu onemocnění od těch lehčích až po nekrózu orgánů či smrt. Nejvíce aflatoxiny postihují játra, kde dochází k jejich odbourávání a vzniku následných metabolitů, které jsou pro tělo nejtoxičtější. Z tohoto důvodu je jejich přesné stanovení a porozumění principu jejich účinků velmi důležité. V práci byly kalibrovány metody pro sledování a k bližšímu určení vlivu aflatoxinů na lidské buňky. K tomuto sledování byly použity metody: MTT testy viability, fluorescenční mikroskopie a průtoková cytometrie. Jako další bylo proměřeno množství přítomných aflatoxinů v různých potravinách s odlišnými podmínkami skladování. Pro tuto analýzu byly použity ELISA testy RIDASCREEN Aflatoxin Total a RIDA Aflatoxin column. Kalibrované metody byly porovnány s metodami již používanými pro stanovení vlivu aflatoxinů a výsledky ELISA testů byly porovnány s limity množství aflatoxinů povolenými Českou legislativou. Žádná z kontrolovaných potravin neobsahovala nadlimitní koncentraci aflatoxinů, která je v České republice stanovena na 4-10 µg/l (liší se pro různé druhy potravin). Nejvyšší hodnoty aflatoxinů vykazovaly potraviny, které byly špatně skladovány ale nebyly viditelně napadeny plísněmi. Byla stanovena hodnota LD50 pro aflatoxin B1 na 12,25 µM. Pomocí průtokové cytometrie byl stanoven druh buněčné smrti, kterou aflatoxin způsobil a tato data byla dále potvrzena díky snímkům z fluorescenční mikroskopie.
|
|
|
Influence of oxidative pressure on bacterial cells
Dugová, Hana ; Pernicová, Iva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
This bachelor thesis deals with the impact of oxidative pressure on the bacterial strain Cupriavidus necator in its two forms: Cupriavidus necator H16 producing PHB granules and Cupriavidus necator PHB-4 as a mutant that is not capable of producing granules. The thesis compares different influences causing oxidative stress that is demonstrated by the occurrence of ROS in the cell. Furthermore, the cells were analysed with a flow cytometer and a fluorescence microscope. During the analysis it was necessary to use different types of fluorescence probes. The oxidative stress was created by means of hydrogen peroxide at various concentrations. Further tests focused on Fenton’s reaction including ammonium iron sulfate and cobalt chloride hexahydrate. Propidium iodide as a fluorescence probe was used to determine the viability of the bacterial cells, and BODIPY was tested as a lipophilic dye. Finally, the ROS in the cell was detected by H2DCFDA and CM–H2DCFDA, fluorescence probes that had to be optimised for the respective technique. The result of this bachelor thesis is the confirmation of the hypothesis that PHA granules production increase the resistance of Cupriavidus necator against oxidative stress.
|
|
|
Studium produkce PHA u extremofilnich zástupců rodu Bacillus a příbuzných rodů
Reinohová, Nikola ; Kouřilová, Xenie (oponent) ; Pernicová, Iva (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce je zaměřena na studium produkce polyhydroxyalkanoátů pomocí extremofilních zástupců rodu Bacillus a příbuzných rodů. V rámci práce byly zkoumány jak sbírkové mikroorganismy Ureibacillus composti DSM 171951, Alkalibacillus haloalkaliphilus DSM 5271, Alicyclobacillus acidocaldarius DSM 446, Halobacillus halophilus CCM 3527, Thermobacillus composti DSM 18247 a Bacillus licheniformis CCM 2206, tak i izolované mikroorganismy z přírodních zdrojů Aneurinibacillus thermoaerophilus LK7, Aneurinibacillus thermoaerophilus F109, Aneurinibacillus thermoaerophilus AFn2, Geobacillus thermodenitrificans F101, Geobacillus thermodenitrificans F102, Geobacillus stearothermophilus A12 a Geobacillus sp. AH11.V teoretické části jsou popsány extremofilní mikroorganismy, polyhydroxyalkanoáty a jejich využití. V experimentální části byla provedena detekce produkce PHA na úrovni genotypu pomocí metody PCR, kde byla zjišťována přítomnost PHA syntáz první a čtvrté třídy pro určité zástupce a taktéž přítomnost genu 16SrRNA. Dále byla testována produkce PHA na úrovni fenotypu, kde se testovala utilizace různých uhlíkových zdrojů a schopnost mikroorganismů tvořit s různými prekurzory kopolymery 4HB a 3HV při různých teplotách. Kopolymery jsou velice zajímavé svými vlastnostmi, díky kterým mají širokou škálu využití. Jako nejlepším zástupcem se pro produkci PHA v této práci ukázal mikroorganismus Aneurinibacillus thermoaerophilus AFn2 s produkcí PHA až 1,99 g/l a kopolymeru 3HV až 0,49 g/l.
|
|
|
Biotransformace kyseliny ferulové na senzoricky aktivní látky
Opial, Tomáš ; Pernicová, Iva (oponent) ; Obruča, Stanislav (vedoucí práce)
Bakalárska práca sa zaoberala biotransformáciou kyseliny ferulovej na senzoricky aktívne látky. Experiment bol založený na sledovaní biotransformačného potenciálu vybraných mikroorganizmov metódou vysoko účinnej kvapalinovej chromatografie (HPLC) pričom kultivácia prebiehala v dvoch paralelných prevedeniach a vzorky s pridanou kyselinou ferulovou boli rozdelené na 24 hodinové pôsobenie a 48 hodinové pôsobenie kyseliny ferulovej na bakteriálne kultúry. Bolo zistené, že termofilné baktérie a halofilná baktéria Halomonas neptunia sú najvhodnejšími kandidátmi na biotransformáciu kyseliny ferulovej na senzoricky aktívne látky. Pri oboch vzorkách baktérii Schlegelella thermodepolymerans (DSM 15344 a DSM 15264) došlo k vzniku 33 mg/l a 76 mg/l kyseliny vanilovej a 81 mg/l a 71 mg/l 4-vinylguaiacolu po 24 hodinovom pôsobení kyseliny ferulovej. U vzorky s baktériou T. taiwanensis po 48 hodinovom pôsobení kyseliny ferulovej vzniklo 61 mg/l kyseliny vanilovej a 32 mg/l 4-vinylguaiacolu a u vzorky R. xylanophilus 56 mg/l 4-vinylguaiacolu. U vzorky s baktériou H. neptunia po 24 hodinovom pôsobení kyseliny ferulovej došlo k jej premene na 296 mg/l kyseliny vanilovej, čo činilo až 59% konverzie pôvodnej kyseliny ferulovej a u vzorky s baktériou H. organivorans po 24 hodinovom pôsobení kyseliny ferulovej vzniklo 71 mg/l kyseliny vanilovej. Avšak po 48 hodinovom pôsobení kyseliny ferulovej kyselina vanilová degradovala. Okrem screeningu biotransformačného potenciálu sa vykonalo aj porovnanie sekvencie bakteriálnych enzýmov, podieľajúcich sa na biotransformácii, s proteínovými sekvenciami v databáze pomocou vyhľadávacieho nástroja BLAST. Prítomnosť génov kódujúcich enzýmy podieľajúcich sa na biotransformácii bola dokázaná takmer pre všetky používané mikroorganizmy okrem baktérie H. neptunia, pre ktorú nebol dokázaný ani jeden gén. Najväčší počet prítomných génov u baktérii bol pri enzýmoch feruloyl-CoA-syntetáza, enoyl-CoA hydratáza/izomeráza, acetoacetyl-CoA thioláza a vanilín dehydrogenáza.
|
|
|
Screening produkce extremozymů u vybraných extrémofilních producentů PHA
Dyagilev, Dmitry ; Obruča, Stanislav (oponent) ; Pernicová, Iva (vedoucí práce)
Tato bakalářská práce se zabývá screeningem produkce extraceluárních hydrolytických enzymů u termofilních mikroorganismů rodů Aneurinibacillus, Brevibacillus, Chelatococcus Pseudomonas, Schlegelella, Tepidimonas a Caldimonas. U zkoumaných mikroorganismů byla testována schopnost produkce vybraných enzymů, konkrétně proteáz, lipáz, amyláz, xylanáz, celuláz a pektináz. Takové testování dalo možnost posoudit, u kterých mikroorganismů je možné pozorovat produkci konkrétních enzymů. Na základě výsledků screeningu bylo zjištěno, že Schlegelella aquatica LMG 23380, Tepidimonas fonticaldi LMG 26746 a zkoumané mikroorganismy z rodu Chelatococcus neprojevily schopnost extracelulárně produkovat žádný z testovaných enzymů. U přírodních izolátů Brevibacillus borstelensis LK 99 a Aneurinibacillus thermoaerophilus LK 102 byla detekována pouze schopnost produkce lipolytických enzymů. Jako univerzální producent všech vybraných extremozymů vystupuje izolát Brevibacillus borstelensis Bz. U vybraných producentů bylo provedeno stanovení aktivity enzymů. Bakterie Brevibacillus borstelensis Bz dokázala schopnost produkce všech šesti vybraných hydrolytických enzymů a také má nejvyšší aktivitu lipáz, xylanáz, celuláz a pektináz z testovaných mikroorganismů. Nejvyšší proteolytickou aktivita byla naměřena u bakterie Thermomonas hydrothermalis DSM 14834 při kultivaci na odstředěném sušeném mléce.
|
|
|
Studium exprese genů u bakterie Cupriavidus necator a dalších vybraných producentů polyhydroxyalkanoátů
Centnerová, Radmila ; Šedrlová, Zuzana (oponent) ; Pernicová, Iva (vedoucí práce)
Bakalářská práce se zabývá studiem exprese genů bakterie Cupriavidus necator H16, která je známa jako modelový organismus metabolismu polyhydroxyalkanoátů. V první části této práce byla provedena optimalizace metodiky RT-qPCR, jež byla posléze použita pro studium genové exprese. Dále byly porovnávány různé komerční kity pro izolaci genomické DNA, izolaci RNA, a pro reverzní transkripci a vznik komplementární DNA. Z dostupných kitů byl vybrán ten, se kterým bylo dosaženo nejrelevantnějších výsledků a zároveň byla snadná a bezpečná práce. Při izolaci bylo dosaženo rozdílných výtěžků pro jednotlivé kity, použitý kit má tak velmi významný vliv na kvalitu získané nukleové kyseliny a tím i na úspěšnost celého měření. Izolovaná genomická DNA byla použita pro účely optimalizace a kalibrace. Izolovaná RNA a komplementární DNA byly použity ve druhé části práce, ve které byla studovaná bakterie kultivována na různých uhlíkatých substrátech. Poté bylo pomocí optimalizované RT-qPCR metodiky provedeno studium exprese vybraných genů zapojených do biosyntézy polyhydroxyalkanoátů. Významnější změny v genové expresi byly obecně zaznamenány tehdy, když byla jako uhlíkatý substrát použita fruktóza oproti tomu, když byl použit -butyrolakton. Největší nárůst exprese genů byl při kultivaci na fruktóze zaznamenán pro gen, kterým je kódována 4-hydroxyfenylacetát-3-hydroxyláza. Při kultivaci na -butyrolaktonu byly významnější změny v expresi pozorovány pouze pro gen kódující 4-hydroxybutyrát dehydrogenázu. Výběr substrátu má tedy zásadní vliv na genovou expresi.
|
host ::
RSS.