|
|
Analýza promotorů genů kódujících faktory sigma u patogenních korynebakterií s využitím modelu Corynebacterium glutamicum
Kučera, Tomáš ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Mikušová, Gabriela (oponent)
Cílem této diplomové práce bylo identifikovat potenciální promotory genů kódujících faktory sigma u patogenních korynebakterií s využitím modelové bakterie Corynebacterium glutamicum a posoudit vliv sekvence aminokyselin proteinů sigma na rozpoznání promotoru. Faktory sigma jsou nezbytné pro transkripci a regulaci genové exprese a hrají klíčovou roli při řízení aktivity promotorů. Pochopení regulace genů kódujících faktory sigma je zásadní, protože přispívají k virulenci a patogenitě a regulují obrannou reakci proti imunitnímu systému hostitele. V této práci se analyzovaly promotorové oblasti genů kódujících faktory sigma u bakterií Corynebacterium ulcerans a Corynebacterium diphtheriae. Nejprve byly identifikovány potenciální sekvence promotorů v genomech C. ulcerans a C. diphtheriae na základě znalosti konvenčních sekvencí potvrzených promotorů v modelovém organismu. Vyhodnocení aktivity navržených promotorových oblastí sloužil odzkoušený dvouplazmidový systém vytvořený v C. glutamicum. Do vektoru pEPR1 byla vložena potenciální promotorová oblast před reportérový gen gfpuv a do vektoru pEC-XT99A byly před inducibilní promotor vloženy geny faktorů sigma. S využitím fluorescence se měřila aktivita reportérového genu v reakci na indukovaný faktor sigma z C. glutamicum, C. ulcerans nebo C....
|
|
| |
|
|
Intestinal metabolism of bilirubin
Jirásková, Alena ; Branny, Pavel (vedoucí práce) ; Španová, Alena (oponent) ; Pátek, Miroslav (oponent)
CONCLUSIONS In this study we focused on the process of bilirubin reduction catalyzed by an anaerobic intestinal bacterium C. perfringens. We aimed to undertake analysis of bile pigments metabolized by C. perfringens anď their respective reduction products and to identify gene(s) encoding protein(s) involved in metabolism of bilirubin. Analysis of bile pigments metabolized by C. perfringens and their respective reduction products 1) The C. perfringens strain BRl isolated from neonatal stools reduces a variety of different bile pigments indicating that this broad subsfiate specificiý could be an effective tool for disposal of electons produced in catabolic processeswithin thesebacteria. 2) The examined strain reduces UCB only to the level of urobilinogen. Other bacterial stains and species, absent in neonates, are preslrmed to be essential for catabolism to the level ofstercobilinogen. Identification of gene(s)involved in bilirubin metabolism l) The C. perfringens strain BRl is resistantto the toansformationof plasmid DNA mediatedby electroporation and thereforeit is not a candidate suitable for transposonmutagenesis. 2) A transformable C. perfringens P90.2.2. strain was found to reduce bilirubin. Rapid and simple method suitable for electroporation of this stoain was developed providing transformation...
|
|
|
Studium regulace biosyntézy větvených aminokyselin u Corynebacterium glutamicum a konstrukce kmene produkujícího valin
Holátko, Jiří ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Petříček, Miroslav (oponent) ; Svobodová, Jaroslava (oponent)
Souhrn L-valin je esenciáIníaminokyselin4 kteú má vellcý význam v medicíně a průmyslu. Proto stale roste potřeba účinnéhobakteriálního producenta této aminokyseliny. Druh Corynebacterium glutamiczzr je vhodným organismem pro konstrukci takovéhoprodukěního kmene a biosyntézavalinu i exprese genů zučastněnýchvjeho biosyntetické drrázejsou tudížintenzivně studovany. V této disertačnípráci byla provedena analýza regulace a modulace exprose genů"které: (1) kódují enzymy společnépro biosyntézuvšech tří větvených aminokyselin; (2) determinujíreakce v konkurenčníchbiosynteticlcých drahách L.isoleucinu a L- leucinu; a (3) genu, kteý kóduje klíčoý enzym katabolismupyruvátu.Výsledky byly využiý pro konstrukci produkčníchhnenů C. glutamicum s deregulovanou biosyntézou valinu, omezenou biosyntézou isoleucinu a leucinu a s optimáIní distribucí intermediátůvalinu. Produkčníkmeny byly manipulovany modifikací promotonl v chÍomosomu.Promotory gen.ůilvA, leuA, ilvD, ilvE a ace:E by|y modifikovfury místně-specifickoumutagenezíjejich oblastí -10. Všechny ýto změny zvýšily u mutantrích kmenůprodukci valinu. Zavedeni slabých promotorů P.ilvA a P.leuA do chromosomu C' glutamicum zpttsobilo sníženíbiosyntézy isoleucinu nebo leucinu a niíslednoubradytrofii na tyto aminokyseliny, která je ýhodnější neŽ auxotrofie navozsná...
|
|
|
Překryvy regulonů faktorů sigma RNA polymerázy u Corynebacterium glutamicum
Zíková, Jaroslava ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Sudzinová, Petra (oponent)
Faktor sigma (σ) je součástí enzymového komplexu RNA polymerázy. Tento komplex (označovaný jako holoenzym) zajišťuje rozeznání konvenční (consensus) sekvence promotorů jednotlivých genů a iniciaci transkripce. U bakterie Corynebacterium glutamicum bylo nalezeno sedm faktorů. Genom této bakterie kóduje jeden primární faktor σA a dalších šest alternativních faktorů sigma: σB , σC , σD , σE , σH a σM . Tyto alternativní faktory sigma se exprimují v reakci na změny vnitřního nebo vnějšího prostředí a zajišťují přizpůsobení bakterie růstovým podmínkám. Jsou také jedním z mnoha regulátorů exprese genů na úrovni transkripce. Ve specifických případech je regulace exprese genů způsobena alternativními faktory sigma, které rozeznávají příslušné duální (rozpoznávané alternativně dvěma faktory sigma) nebo překrývající se promotory. Tím se geny řízené těmito promotory dostávají do překrývajících se sigma regulonů. Klíčová slova: Corynebacterium glutamicum, faktor sigma, RNA polymeráza, transkripce, promotor, regulony, RNA-seq, in vitro transkripce, in vivo dvouplazmidový test
|
|
|
Stresové odpovědi kmenů rodu Rhodococcus
Křenková, Lucie ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Cajthaml, Tomáš (oponent)
Bakterie si během evoluce vyvinuly důmyslné mechanismy, které jim umožňují přežívat a růst v nehostinných podmínkách s extrémními hodnotami teploty, vodní a osmotické aktivity a pH. Bakterie rodu Rhodococcus jsou ve schopnosti přizpůsobit se takovýmto extrémům natolik efektivní, že jsou schopny růst i v přítomnosti toxických sloučenin, čímž mezi bakteriemi vynikají. Jejich velký genom ukrývá velké množství genů využitelných v široké škále katabolických drah. Využitelnost v biotechnologiích je podmíněna znalostí mechanismů stresových odpovědí. Kmeny rhodokoků na stresové podmínky reagují změnou exprese genů pomocí transkripčních regulátorů, dvousložkových systémů a sigma faktorů RNA polymerázy. Základním modelem odpovědi na stresové podmínky je zvýšení exprese chaperonů, chaperoninů a proteáz, které opravují či degradují poškozené proteiny. Většina stresových odpovědí je velmi komplexních a překrývají se také skupiny genů, které na ně reagují. Interpretace výsledků studií na toto téma je tedy velmi náročný, avšak pro optimalizaci využití v biotechnologiích naprosto nezbytný proces. Klíčová slova: stresové odpovědi, bakterie, Rhodococcus, biotechnologie, degradace, toxické sloučeniny, sigma faktor
|
|
|
Funkce stresových sigma faktorů RNA polymerasy SigD, SigE, SigH a SigM v transkripční regulační síti Corynebacterium glutamicum
Dostálová, Hana ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Bobek, Jan (oponent) ; Halgašová, Nora (oponent)
Grampozitivní bakterie Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 je významným průmyslovým producentem aminokyselin a dalších metabolitů. Její genom kóduje 7 podjednotek sigma (σ) RNA polymerázy: primární faktor σA , primárnímu faktoru podobný σB a pět alternativních faktorů sigma, σC , σD , σE , σH a σM (faktory s extracytoplazmatickou funkcí). Tato práce se zaměřila na odhalení dosud neznámých regulonů stresových faktorů sigma nebo upřesnění popisu regulonů, jejichž geny jsou řízeny faktory σD , σE , σH a σM , které byly zčásti popsány pro svou aktivitu při odpovědích na povrchový (σD a σE ), tepelný (σE , σH a σM ) a oxidativní stres (σH a σM ). Vycházeli jsme z toho, že geny každého regulonu jsou přepisovány z jedné třídy promotorů. Pro účely detailní analýzy promotorů bylo třeba vyvinout metody, které rychle a spolehlivě přiřadí faktor sigma k jednotlivým promotorům, a tedy i genům. K tomuto účelu byla vyvinuta kombinace metod in vivo (dvouplazmidový systém) a in vitro (in vitro transkripce) umožňující zpřesnit toto přiřazení. Těmito metodami jsme identifikovali 9 σH /σE -promiskuitních promotorů (PamtR, Pcg0378, Pcg1121, Pcg3309, Pcg3344, PclgR, PdnaJ, PdnaK a PsigB), 7 σD /σH -promiskuitních promotorů (Pcg0607, Pcg2047, Pcmt2, PfadD2, Plpd, PlppS a PrsdA) a 9 σH /σM -promiskuitních promotorů...
|
|
|
Regulační síť řízená sigma faktory RNA polymerasy v Corynebacterium glutamicum
Kučera, Tomáš ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Roučová, Kristina (oponent)
Důležitou vlastností bakterií je schopnost přizpůsobit se změně prostředí pomocí regulace exprese genů. Úroveň exprese genů a její načasování závisí hlavně na aktivaci nebo represi daného genu transkripčními regulátory a rozpoznání příslušeného promotoru faktorem sigma, který je podjednotkou RNA polymerázy. Transkripční regulátory společně s faktory sigma a dalšími řídícími elementy tvoří komplexní regulační síť. Regulační síť v Corynebacterium glutamicum je díky sekvenaci genomu a aplikaci řady technik na úrovni genomu jednou z nejlépe prostudovaných v rámci grampozitivních bakterií. Bylo dosaženo mnoha úspěchů v porozumění rolí jednotlivých regulátorů a interakcí mezi regulátory v závislosti na změnách prostředí. Tato práce shrnuje dosud známé poznatky vzájemných vztahů mezi faktory sigma, vlivu faktorů sigma na transkripčními regulátory a jejich společné působení na iniciaci transkripce. V práci je schématicky vytvořena regulační síť faktorů sigma v C. glutamicum a regulační kaskáda v reakci na stresovou situaci. Klíčová slova: faktor sigma (FS), Corynebacterium glutamicum, transkripční regulátor (TR), transkripce, regulace
|
|
|
Intestinal metabolism of bilirubin
Jirásková, Alena ; Branny, Pavel (vedoucí práce) ; Španová, Alena (oponent) ; Pátek, Miroslav (oponent)
CONCLUSIONS In this study we focused on the process of bilirubin reduction catalyzed by an anaerobic intestinal bacterium C. perfringens. We aimed to undertake analysis of bile pigments metabolized by C. perfringens anď their respective reduction products and to identify gene(s) encoding protein(s) involved in metabolism of bilirubin. Analysis of bile pigments metabolized by C. perfringens and their respective reduction products 1) The C. perfringens strain BRl isolated from neonatal stools reduces a variety of different bile pigments indicating that this broad subsfiate specificiý could be an effective tool for disposal of electons produced in catabolic processeswithin thesebacteria. 2) The examined strain reduces UCB only to the level of urobilinogen. Other bacterial stains and species, absent in neonates, are preslrmed to be essential for catabolism to the level ofstercobilinogen. Identification of gene(s)involved in bilirubin metabolism l) The C. perfringens strain BRl is resistantto the toansformationof plasmid DNA mediatedby electroporation and thereforeit is not a candidate suitable for transposonmutagenesis. 2) A transformable C. perfringens P90.2.2. strain was found to reduce bilirubin. Rapid and simple method suitable for electroporation of this stoain was developed providing transformation...
|
|
|
Vlastnosti expresních vektorů pro Corynebacterium glutamicum a jejich využití při studiu faktorů sigma RNA polymerasy
Dvořáková, Pavla ; Pátek, Miroslav (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Cílem práce bylo charakterizovat vybrané expresní vektory pro biotechnologicky významný bakteriální druh, Corynebacterium glutamicum, a testovat možnosti jejich využití při studiu řízení aktivity promotorů faktory sigma RNA polymerasy. Měřením míry exprese modelového genu gfpuv stanovením intenzity fluorescence produkovaného proteinu a použitím analýzy populace buněk C. glutamicum exprimujících gen gfpuv pomocí průtokové cytometrie byly u studovaných vektorů zjištěny odlišné vlastnosti: míra exprese klonovaného genu, bazální hladina exprese bez induktoru, závislost míry exprese na koncentraci induktoru a stupeň homogenity buněk z hlediska exprese genu gfpuv. Pro testování biplasmidového systému pro přiřazení faktoru sigma k vybranému promotoru byl zvolen vektor pEC-XT99A, který sice neměl vysokou účinnost exprese, ale nevykazoval bazální expresi, exprese byla srovnatelná v širší škále koncentrací induktoru IPTG a buněčná populace byla z hlediska exprese modelového genu zcela homogenní. S využitím vektoru pEC-XT99A, který exprimoval jednotlivé geny pro stresové faktory sigma, byl dosud neznámému promotoru Pcg0420 jednoznačně přiřazen faktor σD , který řídil jeho funkci. Další vektor, určený pro izolaci a purifikaci proteinů z C. glutamicum, umožnil expresi genu sigM z C. glutamicum a izolaci proteinu σM...
|
host ::
RSS.