|
|
Vývoj nové technologie detekce DNA mutací pro využití v onkologické diagnostice
Janoušková, Kristýna ; Minárik, Marek (vedoucí práce) ; Klepárník, Karel (oponent)
Cílem této diplomové práce bylo otestovat novou technologii detekce DNA mutací a optimalizovat parametry související se zavedením nové metody, která tuto technologii využívá, do onkologické diagnostické praxe. Nová metoda spočívá v experimentální modifikaci již používané metody pro detekci somatických mutací v nádorové DNA, která je založena na heteroduplexní analýze a denaturační kapilární elektroforéze. Novým aspektem je využití specifické sondy, krátkého oligonukleotidu, jehož použití výrazně zjednodušuje interpretaci data a nově také umožňuje současné vyšetření více mutací v jedné reakci (multiplexy). Klíčová slova: DNA, denaturační kapilární elektroforéza, heteroduplex, mutace, PCR, sonda
|
|
|
Vývoj a optimalizace separace oligonukleotidů s využitím nového přístupu recyklační HPLC
Holoubková, Barbora ; Minárik, Marek (vedoucí práce) ; Tesařová, Eva (oponent)
1 Abstrakt Separace biologicky významných látek zahrnující proteiny, peptidy a nukleové kyseliny se v posledních letech staly významnou oblastí aplikací pro různé módy vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Jednou z nich je preparativní separace s cílem izolace čistých produktů syntézy oligonukleotidů. Tyto mají v oblasti současné vědecké i komerční sféry zcela zásadní význam. Hrají nezastupitelnou roli v podobě krátkých sekvencí (primerů či sond) pro celou řadu molekulárních metod zahrnujících polymerázovou řetězovou reakci (PCR), DNA sekvenování, detekci patogenů pomocí specifické hybridizace a podobně. Příprava dokonale přesných a čistých oligonukleotidů bývá často zcela zásadní pro úspěšnost těchto metod, proto velmi záleží na účinnosti izolace cílové sekvence od neúplných produktů syntézy či dalších nechtěných příměsí. Současné postupy zahrnují mimo jiné i preparativní chromatografii, avšak nezřídka kdy mívají standardně používané postupy nedostatečné rozlišení. Koncept recyklační chromatografie, kdy jsou analyty po výstupu z kolony navráceny zpět pro opakovaný průchod kolonou, a tím je zlepšeno jejich rozlišení, je znám od 60 let. V poslední době byl však představen zcela nový koncept, tzv. systému Repetto, kdy jsou segmenty separované směsi sekvenčně vraceny zpět na kolonu bez nutnosti průchodu...
|
|
|
Nestabilita genomu buněk mozkových nádorů. Korelace klinických, morfologických a molekulárně-cytogenetických dat
Kramář, Filip ; Michalová, Kyra (vedoucí práce) ; Minárik, Marek (oponent) ; Novák, Zdeněk (oponent)
Mozkové gliomy jsou primární mozkové nádory. Již dříve bylo prokázáno, že v nádorových buňkách mozkových gliomů se vyskytují některé nenáhodné chromosomové aberace. Cílem této práce bylo pomocí fluorescenční in-situ hybridizace (FISH) na vzorcích mozkových nádorů získaných při operaci stanovit frekvenci určených chromosomových aberací pomocí vybraných centromerických a lokus specifických sond a získaná data porovnat s klinickými a morfologickými údaji. V průběhu 6 let jsme získali celkem 270 vzorků, u 264 jsme provedli FISH analýzu pomocí panelu námi zvolených sond. Tyto získané výsledky jsme pak porovnali s histologickou analýzou odebraných vzorků a vybranými klinickými údaji (věk, Karnofsky skóre, rozsah resekce, celkové přežití). V každé skupině jsme stanovili medián a průměrnou dobu přežití, poté jsme u vybraných parametrů sledovali jejich vliv na celkovou dobu přežití pomocí Kaplan-Meierovy analýzy, rovněž jsme vytvořili Coxův regresní model se stanovením rizika příslušného parametru. U difuzních a anaplastických astrocytomů a anaplastických oligodendrogliomů stoupá riziko rychlé progrese a upgradingu na nádor vyššího grade při nálezu jiných aberací (především amplifikace EGFR, delece RB1, monosomie chromosomu 10, trisomie chromosomu 7, delece CDKN2A). Tito pacienti jsou sledováni v kratších časových...
|
|
|
Využití moderních molekulárně-biologických metod v prevenci, časné diagnóze, predikci léčby a prognóze nádorových chorob
Benešová, Lucie ; Minárik, Marek (vedoucí práce) ; Brdička, Radim (oponent) ; Klepárník, Karel (oponent)
55 5 Závěr V prezentovaných pracích jsme se zabývali vývojem a praktickou aplikací metod pro rychlou, citlivou, vysokokapacitní detekci molekulárních markerů u různých typů nádorových onemocnění. Vyvinuli jsme v této souvislosti dvě nové metodiky. První je založená na cyklujícím teplotním gradientu, který poskytuje efektivnější separaci DNA molekul a možnost opakovaného dávkování v jedné analýze a tedy výrazné zvýšení celkového počtu analyzovaných vzorků 1 . Druhá metodika založená na dynamickém značení DNA molekul interkalačním činidlem během elektroforetické analýzy odstraňuje potřebu fluorescenčně značených primerů a dělá tak analýzy finančně i prakticky dostupnějšími 3 . Obě tyto metodiky jsme následně použili při analýzách klinických vzorků pacientů s nádorovým onemocněním. Výsledky uvedených publikací zaměřených na klinické aplikace ukazují, že vyšetření molekulárních markerů zahrnující mutace, alelické ztráty a jednonukleotidové polymorfismy má široké uplatnění. Charakterizace vzorků kolorekta na molekulární úrovni, jehož optimalizaci jsme provedli, může mít význam při popisu stádia transformace adenomu v karcinom nebo při odhadu prognózy onemocnění na základě detekovaných typů mutací 2 . U pacientů s podezřením na karcinom pankreatu může molekulárně-biologické vyšetření v kombinaci s cytologickým...
|
|
|
Vývoj a validace nové metodiky pro obohacení a detekci cirkulující nádorové DNA u onkologických pacientů
Pláničková, Lenka ; Minárik, Marek (vedoucí práce) ; Kuthan, Martin (oponent)
Nádorová onemocnění jsou v celosvětovém měřítku jednou z nejčastějších příčin úmrtí, přičemž prognóza je obecně lepší, pokud je onemocnění diagnostikováno a léčeno včas. Protinádorová léčba je postupně posouvána od klasické chemoterapie s omezenou účinností a známými negativními vedlejšími účinky směrem k cílené biologické léčbě, která se používá, jsou-li zjištěny specifické genetické mutace. Součástí léčby nádorového onemocnění je také detekce následné progrese založená zejména na sledování nádorových biomarkerů. V současné době je stále více zkoumána možnost vyšetřování molekulárních markerů metodou tzv. tekuté biopsie, na kterou byla tato práce zaměřena. Hlavním cílem práce byl experimentální vývoj a validace metody záchytu ctDNA ze vzorků krevní plazmy na základě detekce vybraných somatických mutací. Vývoj a optimalizace systému založeného na principu denaturační kapilární elektroforézy probíhaly na vzorcích pozitivních na mutace onkogenu KRAS, následně byla provedena klinická část výzkumu na pilotním souboru 21 vzorků krevní plazmy. Na závěr práce byla metoda optimalizována pro detekci markerů BRAF a EGFR. Dílčím cílem práce bylo ověření klinické využitelnosti zvýšením citlivosti detekce a tím i podílu záchytu pacientů v pokročilém stádiu onemocnění. Výsledky práce naznačují možnost využití...
|
|
| |
|
| |
|
|
Nestabilita genomu buněk mozkových nádorů. Korelace klinických, morfologických a molekulárně-cytogenetických dat
Kramář, Filip ; Michalová, Kyra (vedoucí práce) ; Minárik, Marek (oponent) ; Novák, Zdeněk (oponent)
Mozkové gliomy jsou primární mozkové nádory. Již dříve bylo prokázáno, že v nádorových buňkách mozkových gliomů se vyskytují některé nenáhodné chromosomové aberace. Cílem této práce bylo pomocí fluorescenční in-situ hybridizace (FISH) na vzorcích mozkových nádorů získaných při operaci stanovit frekvenci určených chromosomových aberací pomocí vybraných centromerických a lokus specifických sond a získaná data porovnat s klinickými a morfologickými údaji. V průběhu 6 let jsme získali celkem 270 vzorků, u 264 jsme provedli FISH analýzu pomocí panelu námi zvolených sond. Tyto získané výsledky jsme pak porovnali s histologickou analýzou odebraných vzorků a vybranými klinickými údaji (věk, Karnofsky skóre, rozsah resekce, celkové přežití). V každé skupině jsme stanovili medián a průměrnou dobu přežití, poté jsme u vybraných parametrů sledovali jejich vliv na celkovou dobu přežití pomocí Kaplan-Meierovy analýzy, rovněž jsme vytvořili Coxův regresní model se stanovením rizika příslušného parametru. U difuzních a anaplastických astrocytomů a anaplastických oligodendrogliomů stoupá riziko rychlé progrese a upgradingu na nádor vyššího grade při nálezu jiných aberací (především amplifikace EGFR, delece RB1, monosomie chromosomu 10, trisomie chromosomu 7, delece CDKN2A). Tito pacienti jsou sledováni v kratších časových...
|
|
| |
|
| |
host ::
RSS.