|
|
Vliv systému Quorum sensing Staphylococcus aureus na toleranci k antibiotikům
Šaňková, Michaela ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Buriánková, Karolina (oponent)
Staphylococcus aureus je grampozitivní oportunně patogenní bakterie, která především u oslabených jedinců způsobuje řadu chronických infekcí. Největší problém v klinické praxi představují v poslední době hlavně infekce způsobené takzvanými perzistery. Jedná se totiž o subpopulaci buněk, které díky adaptacím na stresové podmínky dokáží odolat i běžně letálním dávkám antibiotik a následně opět vyvolat infekci. Hlavní roli v přepínání mezi aktivní virulentní formou a perzistentním stavem spojeným s tvorbou biofilmu hraje Agr systém, který je zodpovědný za mechanismus quorum-sensing. A právě v tomto systému dochází při chronických infekcích ke hromadění adaptačních mutací, jež ovlivňují schopnost perzistovat. Pro vypracování diplomové práce byly použity klinické izoláty odebírané od pacientů s cystickou fibrózou chronologicky během prvních tří let života. Hlavním cílem práce bylo potvrdit vliv adaptačních mutací na perzistenční schopnosti klinických izolátů a dále také sledovat, jak se v závislosti na působení vybraných antibiotik mění membránový potenciál a metabolická aktivita buněk. Dalším cílem pak bylo vytvořit deleci v genu pro regulátor odpovědi AgrA za použití systému CRISPR/Cas9. Pro charakterizaci perzistenčních schopností byly použity tzv. TD testy (Tolerance Disk Tests) a metoda stanovení...
|
|
|
Vliv adaptačních mutací na vznik perzisterů u Staphylococcus aureus
Hloucalová, Nikola ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Buriánková, Karolina (oponent)
Perzistence představuje přechodný stav, ve kterém jsou bakteriální buňky schopny přežívat antibiotickou léčbu. Nastává stochasticky u malé části populace a umožňuje přeživším buňkám opakovaně vyvolat infekci. Velikost subpopulace perzisterů může být ovlivněna adaptačními mutacemi vzniklými v době chronické infekce v genech souvisejících s regulací přechodu mezi virulentní formou a tvorbou biofilmu. Pro regulaci vstupu a výstupu z perzistence má významnou roli též mezibuněčná komunikace a molekuly produkované buňkami do prostředí. Předpokládá se, že perzistence u S aureus je ovlivňována především PSM moduliny a molekulami AIP, jež se účastní mechanizmu Quorum sensing. Hlavním cílem práce bylo objasnit, jak adaptační mutace vzniklé u klinických izolátů získaných od dvou pacientek s diagnostikovanou cystickou fibrózou ovlivňují schopnost perzistovat. Dále bylo cílem stanovit, jak se v souvislosti s perzistencí mění membránový potenciál a metabolická aktivita a určit, jaký vliv mají extracelulární molekuly produkované do kultivačního média na růstové parametry studovaných izolátů. Metodou TD testu a určením míry perzistence stanovením CFU bylo zjištěno, že u izolátů pacientky 2 nedošlo v průběhu chronické infekce ke vzniku adaptačních mutací ovlivňujících perzistenci, zatímco u třech později odebraných...
|
|
|
Metody charakterizace perzistentního stavu po působení vybraných antibiotik u Staphylococcus aureus
Valtová, Aneta ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Tkadlec, Jan (oponent)
Staphylococcus aureus je oportunní patogen, který může způsobit těžké a chronické infekce. Důvodem recidivy bakteriálních infekcí je často tzv. perzistence. Jde o přizpůsobení se stresovým podmínkám navozením dormantního stavu, který bakteriím umožní přežít vystavení antibiotikům a po jejich eliminici opět vyrůst. Bakterie, které v pacientovi perzistují, získávají různé adaptační mutace, které si předávají a vznikají tu tak subpopulace, které mají lepší schopnost perzistovat. Cílem této diplomové práce bylo porovnat jednotlivé metody studia perzistorů, které by se mohly v budoucnu používat v klinické praxi, a zároveň se pokusit o bližší molekulární charakterizaci perzistentního stavu pomocí metod stanovení genové exprese. K dispozici mi byly chronologické izoláty Staphylococcus aureus, kdy počáteční byl tzv. primoizolát, izolát odebraný při odhalení cystické fibrózy ještě před zahájením antibiotické léčby. Další pak odebraný s odstupem třičtvrtě roku a poslední s půlročním odstupem od předchozího. Po následné celogenomové sekvenaci byly zjištěny geny, ve kterých vznikly adaptační mutace. První metoda určuje míru schopnosti perzistovat podle stanovení CFU (Colony Forming Units) po působení antibiotika. Zjistila jsem, že tato schopnost závisí převážně na adaptaci izolátu a získaných adaptačních...
|
|
| |
|
|
Structure and evolution of efflux pump in gramnegative bacteria.
Gálová, Diana ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Matyska Lišková, Petra (oponent)
Rezistencia mikroorganizmov na antibiotiká je významným problémom a neustále pribúda prípadov patogénnych baktérií rezistentných na bežne užívané antibiotiká. K jedným z hlavných mechanizmov rezistencie u gramnegatívnych baktérií patrí aktívny eflux, schopný udržovať intracelulárnu koncentráciu noxy pod toxickou úrovňou. Efluxné pumpy radíme do piatich rodín transportérov, fungujúcich prevažne na princípe transportu drogy voči protónu, v menšom zastúpení na hydrolýze ATP. U patogénov sú hlavnou príčinou rezistencie pumpy so širokou substrátovou špecifitou, tzv. MDR (multidrug resistance) pumpy, zastúpené hlavne RND nadrodinou. Pôvodcom efluxných púmp sú pravdepodobne producenti antibiotík a organizmy vystavené vo svojom prirodzenom prostredí toxickým látkam. K šíreniu do iných baktérií potom dochádza horizontálnym génovým transférom. Usudzuje sa, že efluxné pumpy sa vyvinuli z transportérov pôvodne zaobstarávajúcich fyziologické funkcie ako transport endogénnych substrátov.
|
|
|
Factors interacting with bacterial RNA polymerase and their effect on the regulation of transcription initiation
Ramaniuk, Volha ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent) ; Valášek, Leoš (oponent)
(ČESKÝ) Bakteriální buňka reguluje svou genovou expresi jako odpověď na změny růstových podmínek. RNA polymeráza (RNAP) je stěžejním enzymem pro tento proces, její aktivita je ovlivňována mnoha transkripčními faktory. Ve své práci se zabývám faktory, které se účastní regulace transkripce u grampozitivních baktérií: faktory σ, iniciačními nukleozid trifosfáty (iNTP), HelD, δ a malou RNA Ms1. Hlavní důraz v této práci je kladen na faktory σ z Bacillus subtilis. Faktory σ rozpoznávají specifickou sekvenci DNA promotoru a umožnují navázaní RNAP na tuto sekvenci. Ve svém prvním projektu jsem vytvořila transkripční systém in vitro s purifikovanými alternativními σ faktory z B. subtilis - σB , σD , σH , σI . Pomocí tohoto systému jsem zkoumala efekt změny koncentrace iNTP ([iNTP]) na iniciaci transkripce. Prokázala jsem, že promotory přepisované pomocí alternativních σ faktorů jsou často regulovány [iNTP]. V dalším projektu jsem charakterizovala jeden z nejméně prozkoumaných alternativních faktorů z B. subtilis, I . Identifikovala jsem ~130 genů ovlivněných I , přitom 16 z nich bylo přepisováno přímoI . Prokázala jsem, že se I účastní metabolizmu železa v buňce, a že se váže nejenom na klasické sekvence -35 a -10, ale také na "prodloužené" -35 a -10 elementy. Ve spolupráci s bioinformatickou...
|
|
|
Studium vlivu genu yxkO Bacillus subtilis na motilitu během odpovědi na osmotický stres.
Streitová, Eliška ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Krásný, Libor (oponent)
Bacillus subtilis je gram-pozitivní půdní bakterie. Ve svém přirozeném prostředí je neustále vystavena změnám chemických a fyzikálních podmínek, včetně změn osmolality. Buňka reaguje na zvýšení osmolality prostředí příjmem draselných iontů a následně transportem a/nebo syntézou kompatibilních solutů. V předchozích letech byl v naší laboratoři s využitím nespecifické inzerční mutageneze (mini Tn10) izolován a charakterizován kmen Bacillus subtilis L-42. Tento kmen vykazuje sníženou schopnost růstu a osmolabilitu na médiích s koncentrací draselných iontů < 1 mmol/l. Inzercí transpozonu došlo k přerušení genu yxkO kódujícího protein prozatím neznámé funkce. Další výsledky získané v naší laboratoři navíc naznačovaly možný vliv přerušení genu yxkO na expresi genu hag kódujícího protein flagelin - majoritní protein vlákna bakteriálního bičíku. Cílem této diplomové práce bylo objasnit, zda přerušení genu yxkO ovlivňuje motilitu, a zda je ovlivněna exprese genu hag na transkripční úrovni. S využitím integračního vektoru pMUTIN4 byl připraven mutantní kmen se specificky zavedenou mutací v genu yxkO v kmeni Bacillus subtilis 1A839, jehož genotyp zajišťuje vyloučení známé transkripční regulace genu hag. Následně byla sledována motilita buněk s využitím světelné a elektronové mikroskopie. Získané výsledky...
|
|
|
Comparison of specific expression in bacterial and yeast biofilms
Kicko, Peter ; Palková, Zdena (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
Tvorba a udržanie biofilmu je komplexný proces, ktorý je podmienený zmenou genetickej expresie. Formovanie biofilmu je pozorované u niektorých prokaryotických i eukaryotických buniek. V priebehu jeho tvorby dochádza k zoskupovaniu buniek, vzniku extracelulárnej matrix a vytvoreniu metabolicky odlíšiteľných buniek častokrát so zvýšenou rezistenciou na antimikrobiálne látky. Táto práca sa zameriava na významné kroky vedúce k vytvoreniu biofilmu spojené so špecifickou genetickou expresiou a poukazuje na podobné a rozdielne procesy u bakteriálnych a kvasinkových buniek. Práca začína porovnaním bunkovej signalizácie, pokračuje porovnaním expresie adhéznych proteínov a extracelulárnych enzýmov, syntézou exopolysacharidov, vznikom extracelulárnej nukleovej kyseliny a v poslednej kapitole je priblížené formovanie perzistorov. Cieľom tejto práce je spojiť získané informácie a prispieť k pochopeniu komplexnosti tohto procesu. Kľúčové slová: biofilm, signalizácia, adhezíny, exopolysacharidy, extracelulárna nukleová kyselina, perzistor
|
|
|
Regulace buněčného cyklu u Bacillus subtilis.
Zelenka, Tomáš ; Lichá, Irena (vedoucí práce) ; Harant, Karel (oponent)
2 Abstrakt Vztahy mezi jednotlivými ději probíhajícími v bakteriální buňce během buněčného cyklu byly v posledních letech předmětem mnoha studií. Díky vyspělejším metodám se ukázalo, že život bakteriální buňky má daleko více proměnlivých faktorů, než jsme se zpočátku domnívali. Relativně nedávné výzkumy dokázaly poodhalit funkci, a v některých případech i molekulární podstatu, jednotlivých mechanismů, které v buňce koordinují procesy od průběhu replikace a její iniciace, segregace chromosomů vznikajících při replikaci, až po synchronizaci složité mašinérie samotného dělení buňky a v neposlední řadě také proměnlivost těchto procesů během měnících se životních podmínek buňky. Klíčová slova: Buněčný cyklus, replikace, segregace chromosomu, cytokineze, Bacillus subtilis
|
|
|
Mutantní glykosidasy s vysokou substrátovou specifitou a jejich analýza
Nekvasilová, Pavlína ; Bojarová, Pavla (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent)
β-N-Acetylhexosaminidasy (EC 3.2.1.52, GH20) jsou retenující exo-glykosidasy, které in vivo odštěpují jak β-N-acetylglukosamin (GlcNAc), tak β-N-acetylgalaktosamin (GalNAc) z glykosylovaných struktur. Za vhodných reakčních podmínek jsou tyto enzymy schopné glykosidovou vazbu i syntetizovat. Cílenou mutagenezí v aktivním centru enzymu lze např. dosáhnout změny substrátové specifity nebo potlačit hydrolytickou aktivitu enzymu ve prospěch syntézy. Předkládaná práce se zabývá třemi mutantními β-N-acetylhexosaminidasami z Talaromyces flavus. V jejich aktivním centru byla provedena záměna aminokyselinových zbytků, které jsou zodpovědné za vazbu hydroxylu na C-4 substrátu (Arg218, Glu546), za aminokyseliny navržené na základě molekulárního modelování. Byl studován vliv vnesených jednobodových mutací na substrátovou specifitu připravených enzymů. Mutantní β-N-acetylhexosaminidasy byly heterologně exprimovány v Pichia pastoris a charakterizovány. Dále byly provedeny transglykosylační reakce s těmito enzymy. Připravené sacharidové produkty byly charakterizovány pomocí NMR.
|
host ::
RSS.