|
|
Základ strukturně-funkční studie vybraných enzymů 4-alkyl- L-prolinové dráhy
Zachovalová, Veronika ; Zdvořáková, Lucie (vedoucí práce) ; Košek, Dalibor (oponent)
4-alkyl-L-prolinový derivát (APD) je stavebním blokem několika důležitých bioaktivních specializovaných metabolitů produkovaných aktinobakteriemi. Nachází se například ve struktuře antibiotika linkomycinu, bakteriálního hormonu s antimikrobiálním účinkem hormaomycinu, antituberkulotika griselimycinu či pyrrolo-1,4-benzodiazepinů (PBD), které mají protinádorové účinky. APD, či jejich prekursory, vznikají z L-leucinu či L-tyrosinu v unikátní biosyntetické dráze tvořené až šesti homologními proteiny označovanými Apd1 - Apd6. První část práce pokládá základ krystalizační studii SAM-závislé methyltransferasy Apd3 z biosyntézy linkomycinu - proteinu LmbW, za účelem objasnění skutečné podoby přirozeného substrátu tohoto proteinu, který je stále předmětem vědeckých diskuzí. Byla optimalizována metoda purifikace poskytující protein LmbW dostatečné kvantity, kvality a čistoty pro krystalizaci, následně byly definovány základní krystalizační podmínky umožňující růst krystalů. Druhá část práce se zabývá objasněním odlišné reakční specifity Apd6 homologních proteinů - F420H2-závislých oxidoreduktas, katalyzujících jedno- (Por15 - biosyntéza PBD porothramycinu) či dvojnásobnou (LmbY - biosyntéza linkomycinu) redukci na identickém substrátu se dvěma konjugovanými dvojnými vazbami. Na základě recentně vyřešené...
|
|
| |
|
|
Příprava mutantních forem fosfatidylinositol 4-kinasy IIα
Gregor, Jiří ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Košek, Dalibor (oponent)
Fosfatidylinositol 4-kinasy (PI4K) jsou enzymy tvořící fosfatidylinositol-4-fosfát, který je důležitou regulační molekulou a prekursorem pro tvorbu dalších regulačních molekul. PI4K jsou zajímavé z medicínského hlediska, neboť je jejich funkce spojována s virovými, nádorovými, metabolickými a neurodegenerativními nemocemi. PI4K typu dva jsou inhibované vápenatými kationty, zatímco PI4K typu III takto inhibovány nejsou. Tato práce řeší vztah struktury a regulace funkce PI4K IIα, konkrétně regulaci vápenatými kationty. Cílem této práce bylo připravit mutovanou formu PI4K IIα, která by nebyla těmito kationty ovlivněna. Přestože se nepodařilo takovou formu připravit, bylo zjištěno, jak aminokyseliny N313, D346 a E193 ovlivňují aktivitu tohoto enzymu.
|
|
|
Příprava konstruktů pro transgenní expresi DPP-IV a FAP
Košek, Dalibor ; Bezouška, Karel (vedoucí práce) ; Křepela, Evžen (oponent)
Příprava konstruktů pro transgenní expresi DPP-IV a FAP Bc. Dalibor Košek Abstrakt: Skupina proteinů DASH (Dipeptidylpeptidase IV aktivitou a/nebo strukturou homologní) představuje soubor multifunkčních molekul, z nichž většina vykazuje peptidasovou aktivitu podobnou dipeptidylpeptidase IV (DPP-IV, EC 3.4.14.5, identická s diferenciačním antigenem lymfocytů CD26). Z proteinů i peptidů obecně odštěpují N-terminální X-Pro dipeptid. Tato práce byla zaměřena na dva proteiny, DPP-IV/CD26, kanonického představitele DASH, a fibroblastový aktivační protein alfa (FAP-α). Jedná se o transmembránové proteiny II. typu s rozdílnou tkáňovou distribucí, u nichž jsou však známé i extracelulární rozpustné varianty. Z dosavadních poznatků vyplývá, že oba mají význam v procesech vzniku a rozvoje mnoha nádorových onemocnění a to mechanismy závislými i nezávislými na enzymatické aktivitě. Pro objasnění jejich úlohy v gliomagenesi bylo navrhnuto připravit experimentální model v podobě glioblastomových buněčných linií s definovatelným fenotypem DPP-IV/CD26 a FAP-α. Bude zahrnovat enzymaticky neaktivní formy proteinů i analogy s různým subcelulárním směřováním. Takovýto model dovolí posoudit vliv DPP-IV/CD26 a FAP-α na rozvoj gliálního nádoru, význam jejich enzymové aktivity a subcelulární distribuce v tomto procesu. Experimenty...
|
|
|
Exprese rekombinantní formy nepenthesinu I z Nepenthes gracilis.
Tretyachenko, Vyacheslav ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Košek, Dalibor (oponent)
Nepenthesin je nespecifickou aspartátovou proteasou láčkovek Nepenthes a Drosera. Přírodní forma se vyznačuje vysokou termostabilitou a odolnosti v širokém rozmezí pH, vlastnostmi, které dovolují použití enzymu pro účely experimentu vodík/deuteriové výměny ve spojení s hmotnostní spektrometrií. Navzdory těmto charakteristikám se ukázalo, že proteasa má relativně nízkou stabilitu vůči denaturačním činidlům (močovina, guanidinium chlorid). Pro vysvětlení tohoto fenoménu je třeba strukturně-funkční analýzy, která dosud nebyla možná z důvodu nízkého množství izolovaného enzymu z láček a jeho dodatečné glykosylace. Cílem této práce bylo připravit aktivní rekombinantní formu nepenthesinu v dostatečném množství pro možnost jeho rutinního využívání v experimentech vodík/deuteriové výměny a pro jeho charakterizaci prostřednictvím rentgenstrukturní analýzy.
|
|
|
Příprava DNA vazebné domény transkripčního faktoru FOXK1
Procházková, Valérie ; Novák, Petr (vedoucí práce) ; Košek, Dalibor (oponent)
Transkripční faktory jsou proteiny, které regulují expresi genů v různých typech buněk. Hrají tak důležitou roli v mnoha buněčných procesech od regulace buněčného cyklu až po buněčnou diferenciaci. Pomocí DNA vazebné domény rozpoznávají a váží specifické sekvence DNA. Jedním z typů DNA vazebné domény je doména "forkhead", která se skládá ze 100-110 aminokyselinových zbytků. Tato sekvence je označována jako DBD FOX a připomíná tvar "okřídleného helixu". Proteiny z rodiny FOX interagují s dvouvláknovou DNA pomocí α- helixu H3, který je pro tuto rodinu sekvenčně konzervován. Na vazbě s DNA se dále podílejí i další oblasti DBD, které však sekvenčně konzervovány nejsou a odlišné strukturní rysy přispívají k rozdílné afinitě FOX proteinů k DNA. Odlišnosti v trojrozměrné struktuře mohou také mít vliv na různorodost biologických funkcí proteinů FOX v organismu. Proteiny FOX se dělí do 19 podrodin, mezi které patří i podrodina FOXK, kterou tvoří dva členové FOXK1 a FOXK2. Proteiny FOXK regulují aerobní glykolýzu, buněčnou proliferaci a také karcinogenezi. Jejich zvýšená exprese byla popsána v rakovinných buňkách kosterní tkáně, žaludku, tlustého střeva, prsu, plic, vaječníků aj. Funkce proteinů FOXK v různých typech rakoviny však není dosud velmi prozkoumána. Cílem práce bylo připravit nativní protein DBD...
|
|
|
Zapojení buněčných signálních systémů řízených malými G-proteiny v neuroregenerativních procesech
Dušek, Jakub ; Novotný, Jiří (vedoucí práce) ; Košek, Dalibor (oponent)
Ze současných reviews na téma "buněčná signalizace během neuroregenerace" se G-proteiny opakovaně objevují jako významný zprostředkovatel signálu. Tato práce si stanovila za cíl zjistit v jaké míře souvisí malé G-proteiny s regenerací nervové tkáně a jakými molekulárními mechanismy dochází k indukci regenerace. V textu jsou do širšího společenského kontextu uvedeny patologie nervové soustavy, které jsou způsobeny traumaty nebo neurodegenerativním onemocněním. Stěžejní částí textu je popsání principu fungování jednotlivých rodin malých G-proteinů a jejich vlivu na obnovu nervové tkáně. Tato práce ukazuje, že malé GTPázy jsou pro neuroregeneraci opravdu klíčové a poukazuje na jejich značný terapeutický potenciál. Klíčová slova: neuroregenerace; malá GTPáza; malý G-protein; Ras; signální systémy; neurodegenerace
|
|
|
Úloha protein-proteinových interakcí v regulaci signálních proteinů a enzymů
Košek, Dalibor ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Karpenko, Vladimír (oponent) ; Pompach, Petr (oponent)
CZ Mezi všemi způsoby regulace signalizace mají protein-proteinové interakce přednostní postavení. Jejich studium v různých podmínkách je logickým a důležitým krokem v pochopení molekulárního mechanismu funkcí jednotlivých regulačních procesů. Tato práce je zaměřena na studium tří takových procesů: ASK1 proteinkinasa, důležitý iniciátor proapoptotických dějů, je za fyziologických podmínek udržována v neaktivním stavu v komplexu s proteinem 14-3-3 a TRX1. Za podmínek oxidačního stresu však tyto proteiny disociují a proteinkinasa se stává aktivní. Dalším procesem je interakce proteinu 14-3-3 s fosducinem a studium jeho úlohy v negativní regulaci G proteinové signalizace v rámci biochemie zraku. Třetí proces je aktivace Nth1 prostřednictvím interakce s Bmh1 a vápníkových kationů. Práce si klade za cíl pomocí různých biochemických a biofyzikálních metod, zejména bodové mutageneze, analytické ultracentrifugace, maloúhlového rozptylu rentgenového záření a fluorescenční spektroskopie přispět k objasnění strukturní podstaty výše popsaných dějů a vysvětlit úlohu protein-proteinových interakcí v jejich regulaci. Na základě výsledků získaných těmito metodami byly zjištěny strukturní informace o tvaru a stechiometrii komplexů TRX1 i proteinu 14-3-3 s odpovídajícími vazebnými doménami ASK1 včetně jejich...
|
|
|
Příprava mutantních forem fosfatidylinositol 4-kinasy IIα
Gregor, Jiří ; Šulc, Miroslav (vedoucí práce) ; Košek, Dalibor (oponent)
Fosfatidylinositol 4-kinasy (PI4K) jsou enzymy tvořící fosfatidylinositol-4-fosfát, který je důležitou regulační molekulou a prekursorem pro tvorbu dalších regulačních molekul. PI4K jsou zajímavé z medicínského hlediska, neboť je jejich funkce spojována s virovými, nádorovými, metabolickými a neurodegenerativními nemocemi. PI4K typu dva jsou inhibované vápenatými kationty, zatímco PI4K typu III takto inhibovány nejsou. Tato práce řeší vztah struktury a regulace funkce PI4K IIα, konkrétně regulaci vápenatými kationty. Cílem této práce bylo připravit mutovanou formu PI4K IIα, která by nebyla těmito kationty ovlivněna. Přestože se nepodařilo takovou formu připravit, bylo zjištěno, jak aminokyseliny N313, D346 a E193 ovlivňují aktivitu tohoto enzymu.
|
|
|
Exprese rekombinantní formy nepenthesinu I z Nepenthes gracilis.
Tretyachenko, Vyacheslav ; Man, Petr (vedoucí práce) ; Košek, Dalibor (oponent)
Nepenthesin je nespecifickou aspartátovou proteasou láčkovek Nepenthes a Drosera. Přírodní forma se vyznačuje vysokou termostabilitou a odolnosti v širokém rozmezí pH, vlastnostmi, které dovolují použití enzymu pro účely experimentu vodík/deuteriové výměny ve spojení s hmotnostní spektrometrií. Navzdory těmto charakteristikám se ukázalo, že proteasa má relativně nízkou stabilitu vůči denaturačním činidlům (močovina, guanidinium chlorid). Pro vysvětlení tohoto fenoménu je třeba strukturně-funkční analýzy, která dosud nebyla možná z důvodu nízkého množství izolovaného enzymu z láček a jeho dodatečné glykosylace. Cílem této práce bylo připravit aktivní rekombinantní formu nepenthesinu v dostatečném množství pro možnost jeho rutinního využívání v experimentech vodík/deuteriové výměny a pro jeho charakterizaci prostřednictvím rentgenstrukturní analýzy.
|
host ::
RSS.