|
|
Characterization of serine proteases of Schistosoma mansoni involved in interaction with host
Ulrychová, Lenka ; Horn, Martin (vedoucí práce) ; Schabussova, Irma (oponent) ; Sojka, Daniel (oponent)
Schistosomóza je závažné parazitární onemocnění způsobené motolicemi rodu Schistosoma. I ve 21. století zůstává celosvětovým zdravotním problémem, neboť je jí nakaženo více než 250 milionů lidí v 78 zemích světa. Současná terapie je založena především na dvou lécích, praziquantelu a oxamniquinu. Vzrůstající riziko vzniku rezistence vyvolává potřebu nových alternativních chemoterapeutik nebo vakcín. Proteázy schistosom se podílejí na mnoha kritických interakcích parazita s hostitelem, a proto představují slibné cíle pro vývoj nových léčebných strategií proti schistosomóze. Tato dizertační práce se zaměřuje na charakterizaci serinových proteáz krevničky Schistosoma mansoni a na určení jejich role v interakci s lidským hostitelem za použití genomických a bioinformatických přístupů, včetně metod molekulární biologie RNA a proteinové biochemie. Nejprve byly pomocí funkční proteomiky klasifikovány hlavní typy proteolytických aktivit v exkrečně sekrečních produktech vylučovaných vývojovými stadii S. mansoni žijícími v krvi hostitele. Analýza odhalila komplexnost těchto proteolytických aktivit, které jsou jedinečné pro každé stádium parazitující v lidském hostiteli. U všech studovaných stádií byla v sekrečních produktech detekován významný podíl aktivit serinových proteáz. Následně byla v genomové databázi...
|
|
|
Cathepsins B of the bird schistosome, Trichobilharzia regenti
Dolečková, Kateřina ; Horák, Petr (vedoucí práce) ; Grevelding, Christoph (oponent) ; Horn, Martin (oponent)
1. Overview Schistosomes have achieved first position among parasitic helminths, because some of them are the etiological agents of a serious human parasitic disease, schistosomiasis, which affects over 200 million people in tropical and subtropical countries (WHO, 2001). Other schistosomatids, such as the bird flukes of the genus Trichobilharzia, have also implications for human health. Although they can mature only in specific hosts (birds), their invasive larvae - cercariae - are able to penetrate also human skin due to chemical signals similar to those present on bird skin (Haas and van de Roemer 1998). Repeated infections result in an inflammatory reaction of the skin called cercarial dermatitis. Due to the increasing number of outbreaks all around the world, cercarial dermatitis is cons disease (Kolářová 2007idered as re-emerging ; Larsen et al. 2004). Among schistosomes, Trichobilharzia regenti is the only species described so far having a unique migration route within vertebrate hosts: after penetration of the skin, the invasive larvae enter peripheral nerves and continue via the spinal cord and central nervous system to the nasal cavity of birds, causing neuromotor disorders or paralyses of birds and even experimental mammals (Hrádková...
|
|
|
Acid peptidases of schistosomes and haematophagous monogeneans
Dvořáková, Hana ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Horn, Martin (oponent) ; Sojka, Daniel (oponent)
Krev je komplexní směs bohatá na živiny. Není proto divu, že si hematofágii osvojilo mnoho bezobratlých, včetně mnoho parazitických helmintů. Obecně platí, že zpracování hemoglobinu (a i jiných krevních proteinů) je u krevsajících helmintů založené na evolučně konzervované síti cysteinových a aspartických peptidáz (např. katepsiny L, B and D). Nicméně, některé skupiny helmintů byly z tohoto hlediska opomíjeny - velmi málo informací bylo známo o výskytu těchto enzymů u hematofágních monogeneí. Předkládaná práce se proto zaměřila na molekulární a biochemické vlastnosti peptidáz, které se mohou potenciálně podílet na zpracování krve u monogenea Eudiplozoon nipponicum (Heteronchoinea, Diplozoidae), ektoparazita z žaber kapra obecného. V homogenátu a exkrečně/sekrečních produktech E. nipponcum převažovala aktivita cysteinových aspartických endopeptidáz, s aktivitou typu katepsinu L převažující nad aktivitou typu katepsinu B a doplněné o aktivitu typu cathepsinu D (článek 1). Dále jsme zjistili, že dospělec E. nipponicum exprimuje širokou škálu katepsinů L, které mají odlišné strukturální vlastnosti a tím pravděpodobně i odlišné funkce. Vlastnosti a lokalizace dvou vysoce exprimovaných EnCL naznačují jejich roli při trávení proteinů hostitelské krve. Je překvapivé, že pouze jediný katepsin B je...
|
|
|
Bioaktivní molekuly zapojené do zpracování krve u hematofágních monogeneí čeledi Diplozoidae
Jedličková, Lucie ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Horn, Martin (oponent) ; Sojka, Daniel (oponent)
Monogenea z čeledi Diplozoidae (podtřída Heteronchoinea) jsou krevsající ektoparaziti nacházející se na žábrách kaprovitých ryb. Trávení krve u diplozoidů probíhá intracelulárně v lysozomálním cyklu buněk gastrodermis střeva za přítomnosti peptidáz parazita. Avšak informace o způsobu trávení krve u této skupiny pocházely dosud pouze z ultrastrukturálních a histochemických analýz. Proto jsem se v této práci zaměřila na biochemickou a molekulární charakteristiku vybraných bioaktivních molekul, které by se mohly podílet na zpracování krve dospělci Eudiplozoon nipponicum, a to konkrétně na cysteinové peptidázy typu katepsinů L a B, aspartické peptidázy typu katepsinu D a na inhibitory serinových peptidáz Kunitzova typu. V homogenátech a exkrečně/sekrečních (E/S) produktech dospělců E. nipponicum dominovala aktivita cysteinových peptidáz typu katepsinu L, následovaná aktivitou aspartických peptidáz typu katepsinu D a minoritním podílem aktivity katepsinů B. Hemoglobinolytická aktivita těchto vzorků byla kompletně zablokována inhibitory jmenovaných typů peptidáz. V transkriptomu dospělců E. nipponicum byly objeveny transkripty kódující 10 katepsinů L a pouze 1 katepsin B. Primární struktury kódovaných enzymů byly bioinformaticky a fylogeneticky porovnány. Dva abundantní katepsiny L (EnCL1, EnCL3) byly...
|
|
|
Analysis of secretome from Trichobilharzia regenti cercariae and characterisation of selected peptidases
Konečný, Lukáš ; Kašný, Martin (vedoucí práce) ; Horn, Martin (oponent)
(česky): Motolice Trichobilharzia regenti je neurotropní parazit ptáků z rodiny Schistosomatidae. Cerkárie, invazivní stadium těchto motolic, využívají k aktivní penetraci hostitele exkrečně-sekreční produkty, které obsahují proteolytické enzymy schopné narušit tkáně hostitele zaručit tak úspěšný přenos. Nejvíce zastoupeným enzymem zodpovědným za penetraci cerkárií lidské schistosomy S. mansoni je cerkáriová elastáza. Tato serinová peptidáza je dobře známá pro degradaci kožních proteinů jako je elastin, keratin, kolagen nebo laminin, avšak, aktivní exprese ortologu tohoto enzymu nebyla u rodu Trichobilharzia nikdy prokázána. Z tohoto důvodu panovalo pevné přesvědčení, že cerkárie T. regenti používá k invazi hostitele zejména cysteinové peptidázy, zvláště katepsiny, které byly opakovaně identifikovány v tomto životním stádiu. Abychom posílili tuto hypotézu. inkubovali jsme cerkárie T. regenti v sestavě využívající kachní kůži jakožto stimulant pro vyprázdnění penetračních žláz. Získané ESPs byly analyzovány hmotnostní spektrometrií a poprvé se nám tak podařilo identifikovat proteinovou formu cerkáriové elastázy T. regenti. Produkce aktivního rekombinantního proteinu se bohužel nezdařila v bakteriálním ani kvasinkovém expresním systému, nicméně, naše sekretomická studie společně s dodatečnou qPCR...
|
|
|
Proteolytické systémy krevničky střevní (Schistosoma mansoni).
Fajtová, Pavla ; Horn, Martin (vedoucí práce) ; Bařinka, Cyril (oponent) ; Sojka, Daniel (oponent)
Schistosomóza je závažné parazitární onemocnění člověka, jehož původcem jsou krevničky, krevní motolice rodu Schistosoma. Celosvětově je schistosomózou, která představuje globální světový problém, infikováno přes 200 miliónů lidí a dalších 750 miliónů je vystaveno riziku nákazy. Jediný účinný lék pro léčbu schistosomózy je chemoterapeutikum praziquantel, u kterého je riziko vzniku rezistence. Proteasy krevničky představuji nadějné cílové molekuly pro vývoj nových terapeutických strategií proti schistosomóze. Tato práce se zaměřuje na komplexní charakterizaci proteolytických systémů krevničky Schistosoma mansoni a určení jejich role v interakci s hostitelem. Za prvé byly pomocí metod funkční proteomiky popsány hlavní proteolytické aktivity sekretované jednotlivými vývojovými stádii krevničky, která parazitují v těle člověka. Tato analýza prokázala jejich komplexní a specifickou distribuci s převažujícími serinovými a cysteinovými proteasami a metaloproteasami. Za druhé byly pomocí přístupu chemické genomiky identifikovány povrchové a trávicí proteasy krevničky, konkrétně prolyloligopeptidasa a katepsiny typu B, C a D, jako vhodné cílové molekuly pro terapeutickou intervenci. Prolyloligopeptidasa byla biochemicky charakterizována na úrovni rekombinantního proteinu, byly vyvinuty její účinné...
|
|
|
Calcium and calcium-dependent proteins in the biology of schistosomes
Bartoníček, Zikmund ; Mikeš, Libor (vedoucí práce) ; Horn, Martin (oponent)
Motolice rodu Schistosoma jsou krevní parazité způsobující závažné onemocnění, schistosomózu, které postihuje více než 200 milionů lidí. Vápník je jedním z klíčových prvků pro život schistosom, podobně jako u všech dalších živočichů. U schistosom ovlivňuje například líhnutí vajíčka, penetraci do hostitele, nebo únik před hostitelským imunitním systémem a další důležité procesy. Tyto děje mohou být závislé buď přímo na vápníku, nebo mohou být ovlivňovány pomocí kalcium-dependentních proteinů. Ty mohou být exprimovány buď ve všech životních stádiích, nebo jejich exprese může být specifická pro jednotlivá stádia. Právě díky těmto vlastnostem jsou kalcium dependentní proteiny zajímavými kandidáty pro vývoj vakcíny. První vakcína založená na kalcium-dependentním proteinu se momentálně připravuje k testování na lidech. Do doby, než bude účinná vakcína vyvinuta, je jedinou možností boje se schistosomózou chemoterapie. V současnosti je lékem první volby praziquantel, jehož mechanismus účinku není ještě zcela objasněn, ale je zřejmé, že ovlivňuje homeostázu vápenatých iontů v parazitovi, čímž způsobí, ať už přímo, či nepřímo, jeho smrt. Tato práce se věnuje právě vápníku a kalcium-dependentním proteinům, jelikož se výrazně podílejí na výše zmíněných procesech. Obecné pochopení jejich funkcí jistě rozšíří...
|
|
|
Vlastnosti exkrečně-sekrečních proteinů motolice Fascioloides magna.
Beránková, Kateřina ; Kašný, Martin (vedoucí práce) ; Horn, Martin (oponent)
Fascioloides magna (motolice velká), původem severoamerická jaterní motolice, byla poprvé zaznamenána v České republice již v roce 1930. Tato silně patogenní motolice parazituje především u jelenovitých, ale dokáže napadat i hospodářská zvířata. Exkrečně-sekreční produkty (ES produkty) zahrnují směs biomolekul z exkrečního a sekrečního systému, které se účastní mnoha biologických procesů v životním cyklu nejen fasciolidních motolic (např. migrace juvenilních motolic, únik před imunitním systémem hostitele či účast při trávicích procesech). Díky jejich antigením vlastnostem jsou tyto molekuly často využívány také pro imunodiagnostické účely. Exkrečně-sekreční proteiny z dospělců F. magna a komparativního příbuzného druhu Fasciola hepatica byly separovány a purifikovány pomocí základních biochemických metod (1D, 2D elektroforéza, iontově-výměnná chromatografie) a jejich aktivita byla potvrzena pomocí specifických (fluorogeních peptidových) a nespecifických (želatina) substrátů. Pomocí metod hmotnostní spektrometrie (MALDI TOF/TOF) byl jako nejvíce abundantní peptidolyticky aktivní protein z ES produktů F. magna identifikován katepsin L (FmCL). Rekombinantní analog FmCL byl připraven s využitím expresního systému Pichia pastoris, a aktivita rekombinantního enzymu byla potvrzena opět pomocí...
|
|
|
Cathepsins B of the bird schistosome, Trichobilharzia regenti
Dolečková, Kateřina ; Horák, Petr (vedoucí práce) ; Grevelding, Christoph (oponent) ; Horn, Martin (oponent)
1. Overview Schistosomes have achieved first position among parasitic helminths, because some of them are the etiological agents of a serious human parasitic disease, schistosomiasis, which affects over 200 million people in tropical and subtropical countries (WHO, 2001). Other schistosomatids, such as the bird flukes of the genus Trichobilharzia, have also implications for human health. Although they can mature only in specific hosts (birds), their invasive larvae - cercariae - are able to penetrate also human skin due to chemical signals similar to those present on bird skin (Haas and van de Roemer 1998). Repeated infections result in an inflammatory reaction of the skin called cercarial dermatitis. Due to the increasing number of outbreaks all around the world, cercarial dermatitis is cons disease (Kolářová 2007idered as re-emerging ; Larsen et al. 2004). Among schistosomes, Trichobilharzia regenti is the only species described so far having a unique migration route within vertebrate hosts: after penetration of the skin, the invasive larvae enter peripheral nerves and continue via the spinal cord and central nervous system to the nasal cavity of birds, causing neuromotor disorders or paralyses of birds and even experimental mammals (Hrádková...
|
host ::
RSS.