Národní úložiště šedé literatury Nalezeno 6 záznamů.  Hledání trvalo 0.00 vteřin. 
Exprese a purifikace kinasove domény ASK1 kinasy.
Bártová, Hana ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Gryčová, Lenka (oponent)
Cílem této diplomové práce bylo nalezení optimálních podmínek pro expresi ASK1 kinasy v prokaryotním expresním systému a vývoj purifikačního protokolu umožňujícího přípravu miligramových množství stabilního a rozpustného proteinu. Byly otestovány různé podmínky exprese v bakteriích E. coli s různou teplotou exprese, složením kultivačního média či momentu provedení indukce. Při přípravě purifikačního protokolu byly testovány různé metody purifikace proteinů. Finální protokol je založen na kombinaci chelatační chromatografie a následné gelové permeační chromatografie. Výsledkem diplomové práce je protokol umožňující přípravu 1 mg čisté kinasy ASK1 z 1 litru média.
Studium vztahů mezi strukturou a funkcí C - konce vaniloidního receptoru TRPV1
Gryčová, Lenka ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Heřman, Petr (oponent) ; Urbánková, Eva (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
Vaniloidní receptor TRPV1 je neselektivní kationtový kanál, který je aktivován řadou podnětů, mezi které patří teplota, kyselé pH a množství chemických látek. Aktivita tohoto kanálu může být modulována i molekulami ATP a na jeho regulaci se podílí také kalmodulin. Přestože ATP přímo tento receptor neaktivuje, přítomnost intracelulárního ATP zvyšuje amplitudu proudu u již aktivovaných receptorů. Bylo prokázáno, že ATP přímo interaguje se ATP vazebnou doménou Walker A typu na cytoplazmatickém C- konci. Abychom identifikovali aminokyselinové zbytky, které se účastní vazby ATP na C- konec TRPV1, provedli jsme místně specifické bodové mutace oblasti Walker A motivu: P732A, D733A, G734A, K735A, D736A a D737A. S využitím metod fluorescenční spektroskopie TNP-ATP kompetičních experimentů a značení a zhášení fluorescence FITC jsme identifikovali K735 jako klíčové reziduum pro tuto vazbu. Experimentálně získané údaje byly interpretovány s ohledem na 3D počítačový model C- konce TRPV1 určující vazbu molekul ligandů. Kalmodulin je označován za jednu z významných molekul pro regulaci aktivity TRPV1. Přestože oblast C- konce TRPV1 interaguje s tímto proteinem, v sekvenci C- konce TRPV1 se nenachází žádný z klasických vazebných motivů pro kalmodulin. V této práci jsme detailně popsali tento, ne zcela typický, vazebný...
Studium strukturních rozdílů mezi izoformami 14-3-3 proteinů.
Macáková, Eva ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Gryčová, Lenka (oponent)
Proteiny 14-3-3 jsou regulační proteiny, které se vyskytují v mnoha isoformách ve všech eukaryotických organismech a účastní se řady buněčných dějů. V této práci jsem se zabývala vlivem struktury ohybu H8-H9 u ječmenných isoforem hv 14-3-3A a lidských isoforem 14-3-3ζ na afinitu k vazebnému partnerovi. Z dříve publikovaných výsledků vyplývá, že isoforma hv 14-3-3A se váže s nejmenší afinitou, což může být způsobeno přítomností glycinu v H8-H9 ohybu, na rozdíl od ostatních isoforem, které mají na stejné pozici serin. Vazebnou afinitu jsem zjišťovala jak pro původní protein hv 14-3-3A WT, tak i pro jeho mutant, u kterého byl glycin v H8-H9 ohybu nahrazen serinem. Pro srovnání jsem také provedla měření s lidskou isoformou 14-3-3ζ WT, která v H8-H9 ohybu na studované pozici obsahuje serin, a jejího mutantu, u kterého byl tento serin nahrazen glycinem. Proteiny jsem exprimovala v bakteriích E. coli kmen BL21(DE3) a poté jsem je purifikovala. Disociační konstanty pro vazbu peptidů pRaf značenými sondami FITC a ATTO jsem získala pomocí metod fluorescenční korelační spektroskopie a stacionárního měření intenzity fluorescence. Z naměřených hodnot vyplývá, že v případě lidských i ječmenných isoforem došlo po mutaci ke zhoršení afinty k vazebnému partnerovi.
Studium strukturních rozdílů mezi izoformami 14-3-3 proteinů.
Macáková, Eva ; Gryčová, Lenka (oponent) ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce)
Proteiny 14-3-3 jsou regulační proteiny, které se vyskytují v mnoha isoformách ve všech eukaryotických organismech a účastní se řady buněčných dějů. V této práci jsem se zabývala vlivem struktury ohybu H8-H9 u ječmenných isoforem hv 14-3-3A a lidských isoforem 14-3-3ζ na afinitu k vazebnému partnerovi. Z dříve publikovaných výsledků vyplývá, že isoforma hv 14-3-3A se váže s nejmenší afinitou, což může být způsobeno přítomností glycinu v H8-H9 ohybu, na rozdíl od ostatních isoforem, které mají na stejné pozici serin. Vazebnou afinitu jsem zjišťovala jak pro původní protein hv 14-3-3A WT, tak i pro jeho mutant, u kterého byl glycin v H8-H9 ohybu nahrazen serinem. Pro srovnání jsem také provedla měření s lidskou isoformou 14-3-3ζ WT, která v H8-H9 ohybu na studované pozici obsahuje serin, a jejího mutantu, u kterého byl tento serin nahrazen glycinem. Proteiny jsem exprimovala v bakteriích E. coli kmen BL21(DE3) a poté jsem je purifikovala. Disociační konstanty pro vazbu peptidů pRaf značenými sondami FITC a ATTO jsem získala pomocí metod fluorescenční korelační spektroskopie a stacionárního měření intenzity fluorescence. Z naměřených hodnot vyplývá, že v případě lidských i ječmenných isoforem došlo po mutaci ke zhoršení afinty k vazebnému partnerovi.
Exprese a purifikace kinasove domény ASK1 kinasy.
Bártová, Hana ; Gryčová, Lenka (oponent) ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce)
Cílem této diplomové práce bylo nalezení optimálních podmínek pro expresi ASK1 kinasy v prokaryotním expresním systému a vývoj purifikačního protokolu umožňujícího přípravu miligramových množství stabilního a rozpustného proteinu. Byly otestovány různé podmínky exprese v bakteriích E. coli s různou teplotou exprese, složením kultivačního média či momentu provedení indukce. Při přípravě purifikačního protokolu byly testovány různé metody purifikace proteinů. Finální protokol je založen na kombinaci chelatační chromatografie a následné gelové permeační chromatografie. Výsledkem diplomové práce je protokol umožňující přípravu 1 mg čisté kinasy ASK1 z 1 litru média.
Studium vztahů mezi strukturou a funkcí C - konce vaniloidního receptoru TRPV1
Gryčová, Lenka ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Heřman, Petr (oponent) ; Urbánková, Eva (oponent) ; Krůšek, Jan (oponent)
Vaniloidní receptor TRPV1 je neselektivní kationtový kanál, který je aktivován řadou podnětů, mezi které patří teplota, kyselé pH a množství chemických látek. Aktivita tohoto kanálu může být modulována i molekulami ATP a na jeho regulaci se podílí také kalmodulin. Přestože ATP přímo tento receptor neaktivuje, přítomnost intracelulárního ATP zvyšuje amplitudu proudu u již aktivovaných receptorů. Bylo prokázáno, že ATP přímo interaguje se ATP vazebnou doménou Walker A typu na cytoplazmatickém C- konci. Abychom identifikovali aminokyselinové zbytky, které se účastní vazby ATP na C- konec TRPV1, provedli jsme místně specifické bodové mutace oblasti Walker A motivu: P732A, D733A, G734A, K735A, D736A a D737A. S využitím metod fluorescenční spektroskopie TNP-ATP kompetičních experimentů a značení a zhášení fluorescence FITC jsme identifikovali K735 jako klíčové reziduum pro tuto vazbu. Experimentálně získané údaje byly interpretovány s ohledem na 3D počítačový model C- konce TRPV1 určující vazbu molekul ligandů. Kalmodulin je označován za jednu z významných molekul pro regulaci aktivity TRPV1. Přestože oblast C- konce TRPV1 interaguje s tímto proteinem, v sekvenci C- konce TRPV1 se nenachází žádný z klasických vazebných motivů pro kalmodulin. V této práci jsme detailně popsali tento, ne zcela typický, vazebný...

Chcete být upozorněni, pokud se objeví nové záznamy odpovídající tomuto dotazu?
Přihlásit se k odběru RSS.