|
|
The role of transcription factors in mouse eye development
Sunny, Sweetu Susan ; Kozmik, Zbyněk (vedoucí práce) ; Pavlínková, Gabriela (oponent) ; Fafílek, Bohumil (oponent)
Vidění /zrak je složitý proces, který začíná přenosem a lomem světla přes vysoce specializovanou průhlednou tkáň nazývanou rohovka. Rohovka slouží jako ochranná bariéra a přispívá k zaostřovací schopnosti oka. Vývoj savčí rohovky sestává z několika fází, zahrnující tvorbu rohovkového epitelu (CE), rohovkového stromatu a endotelu (CEn) během embryogeneze, následované postnatální stratifikací epitelu a pravidelnou obnovou odlupovaných povrchových buněk epitelu. Transkripční faktor Paired box protein (Pax) 6 je evolučně konzervovaný transkripční factor, důležitý pro správný vývoj oka. Pro další porozumění úloze Pax6 při vývoji rohovky jsme využili systém Cre-loxP k selektivní inaktivaci Pax6 ve dvou tkáních oka, konkrétně postnatálním CE a tkání "epitelu očního povrchu" (OSE) (rohovka, limbus a spojivka). Vytvořili jsme novou transgenní myší linii s postnatálně specifickou expresí Cre-rekombinázy v CE, Aldh3-Cre. Inaktivace Pax6 v postnatálním CE pomocí Aldh3-Cre vedla k abnormálně tenké rohovce s defekty v buněčné adhezi. Tím jsme přímo prokázali, že Pax6 hraje klíčovou roli v postnatálním vývoji rohovky. Poté jsme selektivně inaktivovali Pax6 v OSE pomocí další specifické myší linie K14- Cre. U těchto myší docházelo ke "konjunktivalizaci" CE a epitelu limbu (přeměně tkáně CE a limbu v tkáň...
|
|
|
Regulation of gene expression by thyroid hormone receptors
Oltová, Jana ; Bartůněk, Petr (vedoucí práce) ; Fafílek, Bohumil (oponent)
Hormony řídí v živých organismech nejrůznější procesy a jejich činnost je zajišťována buď membránovými, nebo jadernými receptory. Tyroidální hormony (THs) významně ovlivňují růst, vývoj a mnoho aspektů metabolismu, embryogeneze a raných fází života. Jejich receptory paří mezi jaderné, tzn. fungují jako ligandem aktivované transkripční faktory a podle kontextu mohou působit jako aktivátory nebo inhibitory transkripce. Receptory tyroidálního hormonu (TRs) jsou kódovány dvěma geny, TRα and TRβ, a pomocí alternativního sestřihu vzniká několik isoforem. Nejzastoupenější forma tyroidálního receptoru se váže na T3-responsivní elementy (TREs) jako heterodimer s retinoidním receptorem X (RXR). Tyroidální receptory jsou schopné vazby na TREs nezávisle na přítomnosti ligandu. TREs se skládají ze dvou nebo více následných sekvencí AGGTCA, které jsou obvykle uspořádány jako dvě přímé repetice oddělené čtyřmi nukleotidy (DR4). TH-responsivní cílové geny jsou součástí mnoha různých buněčných drah. Příkladem takového genu je Disp3, který by mohl v určitých buněčných typech propojovat thyroidální hormony a metabolismus cholesterolu.
|
|
|
Epigenetics in gene regulation and chromatin structure.
Lađinović, Dijana ; Vacík, Tomáš (vedoucí práce) ; Fafílek, Bohumil (oponent) ; Stixová, Lenka (oponent)
1. Souhrn Metylace histonů hraje důležitou roli téměř ve všech buněčných procesech a udržování její správné hladiny zajišťují histon metyltransferázy a histon demetylázy. Nesprávná regulace hladiny metylace histonů je spojena s narušením regulace genové exprese a následně také s různými vývojovými defekty a nemocemi. V této práci jsme se zaměřili na lyzin demetylázy KDM2A a KDM2B a na jejich KDM2A-SF a KDM2B-SF izoformy postrádající demetylační aktivitu. Lyzin demetylázy KDM2A a KDM2B byly studovány převážně pro svojí demetylační funkci, kterou vykonávají na promotorech obsahujících CpG ostrovy. Jejich alternativní izoformy KDM2A-SF a KDM2B-SF však nebyly doposud detailněji studovány. Hlavním úkolem této práce bylo proto podrobně charakterizovat KDM2A-SF a zaměřit se také na roli, kterou by KDM2A-SF a KDM2B-SF mohli potenciálně hrát v kanonické Wnt signalizaci. Zjistili jsme, že KDM2A-SF mRNA vzniká působením alternativního intronového promotoru a není tak produktem alternativního sestřihu. Ukázali jsme, že KDM2A-SF startovní kodón leží v exonu, který odpovídá KDM2A exonu 14 a určili jsme tak přesnou aminokyselinovou sekvenci KDM2A-SF proteinu. Pomocí knockdown experimentů specifických pro jednotlivé KDM2A izoformy jsme dale ukázali, že KDM2A-SF narozdíl od KDM2A-LF vytváří v jádře distiktní struktury na...
|
|
|
Epigenetics in gene regulation and chromatin structure.
Lađinović, Dijana ; Vacík, Tomáš (vedoucí práce) ; Fafílek, Bohumil (oponent) ; Stixová, Lenka (oponent)
1. Souhrn Metylace histonů hraje důležitou roli téměř ve všech buněčných procesech a udržování její správné hladiny zajišťují histon metyltransferázy a histon demetylázy. Nesprávná regulace hladiny metylace histonů je spojena s narušením regulace genové exprese a následně také s různými vývojovými defekty a nemocemi. V této práci jsme se zaměřili na lyzin demetylázy KDM2A a KDM2B a na jejich KDM2A-SF a KDM2B-SF izoformy postrádající demetylační aktivitu. Lyzin demetylázy KDM2A a KDM2B byly studovány převážně pro svojí demetylační funkci, kterou vykonávají na promotorech obsahujících CpG ostrovy. Jejich alternativní izoformy KDM2A-SF a KDM2B-SF však nebyly doposud detailněji studovány. Hlavním úkolem této práce bylo proto podrobně charakterizovat KDM2A-SF a zaměřit se také na roli, kterou by KDM2A-SF a KDM2B-SF mohli potenciálně hrát v kanonické Wnt signalizaci. Zjistili jsme, že KDM2A-SF mRNA vzniká působením alternativního intronového promotoru a není tak produktem alternativního sestřihu. Ukázali jsme, že KDM2A-SF startovní kodón leží v exonu, který odpovídá KDM2A exonu 14 a určili jsme tak přesnou aminokyselinovou sekvenci KDM2A-SF proteinu. Pomocí knockdown experimentů specifických pro jednotlivé KDM2A izoformy jsme dale ukázali, že KDM2A-SF narozdíl od KDM2A-LF vytváří v jádře distiktní struktury na...
|
|
| |
|
|
Study of the role of selected endocytosis regulators in the Wnt signalling pathway
Knop, Filip ; Macůrková, Marie (vedoucí práce) ; Fafílek, Bohumil (oponent)
Signální dráha proteinu Wnt se značnou měrou podílí na ontogenetickém vývoji a homeostázi ve většině mnohobuněčných organismů. Její důležitost je podtržena její konzervovaností v evoluci a také širokým spektrem chorob způsobených její deregulací. Signální dráhu Wnt lze pro názornost rozdělit na dvě poloviny. V první jsou popsány procesy, důležité pro vznik a sekreci Wnt ligandu ve Wnt produkujících buňkách a v druhé procesy, které se odehrávají při transdukci Wnt signálu v buňkách přijímacích. Důležitým procesem v obou typech buněk je endocytóza. Regulací procesu endocytózy je zprostředkovaně regulován výsledek signalizace proteinu Wnt. V této práci byla pro charakterizaci nového regulátoru signální dráhy Wnt na úrovni endocytózy použita jako modelový organismus hlístice Caenorhabditis elegans (háďátko obecné). Tímto novým regulátorem je protein kináza SEL-5.. SEL-5 kináza patří do rodiny NAK kináz a její funkce se zdá být konzervována napříč evolucí. S využitím informací o lidském SEL-5 homologu AAK1 z dostupných databází byla předběžně popsána role SEL- 5 v regulaci signalizace Wnt u háďátka a navrženy experimenty, které by nám umožnily podrobněji prozkoumat jeho roli v této signální dráze. Popsali jsme genetické interakce sel-5 s některými komponenty retromerového komplexu a zjistili, že sel-5...
|
|
|
Rodina proteinů obsahujících sterol-sensing doménu
Ditrychová, Karolína ; Zíková, Martina (vedoucí práce) ; Fafílek, Bohumil (oponent)
Sterol sensing doména (SSD) je transmembránový úsek proteinu skládající se z 5 helixů. Proteiny, které tuto doménu obsahují, jsou součástí mnoha buněčných drah souvisejících s metabolismem cholesterolu. V některých případech bylo ukázáno, že SSD interaguje s molekulou cholesterolu. Poprvé byla popsána během studia 3-hydroxy-3-metylglutaryl-CoA reduktázy (HMG-CoA reduktáza), enzymu účastnícího se biosyntézy cholesterolu. Jeho transkripce je regulována proteinem Sterol regulatory element binding protein Cleavage Activating Protein (SCAP). 3HMG-CoA reduktáza a SCAP byly prvními proteiny, v jejichž struktuře byla SSD rozeznána. Později byl popsán jiný protein s touto doménou, který je také součástí biosyntézy cholesterolu - 7-dehydrocholesterol reduktáza. Další proteiny s identifikovanou SSD, hrají roli v endocytóze cholesterolu a jeho transportu z lysozomů - Niemann-Pick typ C 1 liked 1 a Niemann-Pick typ C 1. Mimoto, jako struktury obsahující SSD byly také popsány proteiny působící v Hedgehogové signalizaci - Patched, Patched-related a Dispatched. Konečně, protein působící jako tumor-supresor TRC8 byl do této rodiny proteinů zařazen také. V této práci je popsána struktura a funkce jednotlivých členů proteinové rodiny obsahující sterol sensing doménu. Klíčová slova: sterol sensing doména, signální...
|
|
|
Adjusting Wnt signaling, new regulatory mechanisms of the Wnt pathway
Fafílek, Bohumil ; Kořínek, Vladimír (vedoucí práce) ; Stopka, Tomáš (oponent) ; Machoň, Ondřej (oponent)
4 Souhrn Signální dráha zahajovaná proteiny Wnt řídí mnoho buněčných procesů během embryogeneze a v dospělém organismu se podílí na homeostáze a regeneraci tkání. Navíc její nefyziologická aktivace bývá často spojována s vznikem rakoviny, zejména karcinomu tlustého střeva. Cílem této práce bylo nalezení nových způsobů regulace signální dráhy Wnt, jež by vedly k hlubšímu pochopení její fyziologické i patologické aktivace. Výsledky, jež jsou pokladem této disertace, jsou shrnuty ve čtyřech publikacích. První článek představuje protein TROY z rodiny receptorů faktoru nekrotizujících nádory. TROY je cílový gen signální dráhy Wnt, který jsme nalezli, když jsme hledali geny deregulované aberantní Wnt signalizací v buněčných liniích kolorektálního karcinomu. Zvýšenou expresi genu Troy jsme detekovali také v nádorech dvou myších modelů střevní rakoviny. Ve zdravé střevní tkáni je gen Troy exprimován pouze v rychle se dělících střevních kmenových buňkách, kde negativně reguluje signální dráhu Wnt. Druhá studie se zaměřuje na post-translační modifikace myších proteinů Wnt1 a Wnt3a. Ligandy Wnt jsou modifikovány jednak cukernými komplexy a jednak dvěma zbytky mastných kyselin. Naše výsledky odhalili, že modifikace konzervovaného serinu zbytkem kyseliny palmitolejové je potřebná pro následnou modifikaci konzervovaného...
|
|
|
Mechanismy regulace aktivity proteinu MTM-6 na endosomech.
Horázná, Monika ; Macůrková, Marie (vedoucí práce) ; Fafílek, Bohumil (oponent)
Signální dráha proteinu Wnt je jednou z konzervovaných signálních drah a jejím prostřednictvím lze řídit rozhodování o osudu buňky, vývoj, regeneraci a homeostázi v tkáních dospělého organismu. Narušení či nesprávná regulace této dráhy vede často ke vzniku onemocnění. Proteiny rodiny Wnt jsou hydrofobní glykoproteiny, které potřebují speciální receptor pro transport z Golgiho aparátu na povrch buňky. U Caenorhabditis elegans se tento receptor nazývá MIG-14, u savců Wntless (Wls). V této práci se soustředím na studium mechanismů, které ovlivňují aktivitu proteinu MTM-6. MTM-6 je lipidová fosfatáza, u které bylo nedávno objeveno, že reguluje transport MIG- 14/Wls v Caenorhabditis elegans. Umlčení genu mtm-6 vede ke špatné regulaci procesů řízených Wnt signalizací, jako je například migrace potomků Q neuroblastů. V této práci jsou identifikovány nové geny, které vykazují genetickou interakci s mtm-6 a skrz Wnt signální dráhu ovlivňují migraci potomků Q neuroblastů. Nové poznatky o genetických interakcích mtm-6 nás přibližují k pochopení regulace signální dráhy proteinu Wnt. Klíčová slova: Caenorhabditis elegans, MTM-6, SEL-5, Wntless, Wnt, endosomy, fosfoinositidy, retromer
|
|
|
Generation of transgenic mouse model to study biological role of KLK5 in epidermis
Kašpárek, Petr ; Sedláček, Radislav (vedoucí práce) ; Fafílek, Bohumil (oponent)
Klk5 patří mezi nejvýznamnější proteolytické enzymy v pokožce a podílí se na procesech jako je deskvamace, štěpení antimikrobiálních peptidů nebo indukce zánětlivé reakce. Role Klk5 v epidermis byla dosud popisována na základě experimentů in vitro, je proto nezbytné potvrdit jeho funkci in vivo. Tato práce si kladla za cíl vytvořit metodické postupy pro zacílení genové exprese myších kalikreinů do svrchní vrstvy pokožky a připravit transgenní myší model exprimující mKlk5 v pokožce. Prvním krokem byla příprava transgenních myší exprimujících fluorescenční marker tdTomato pod kontrolou upraveného involukrinového promotoru. Vytvořené transgenní myši vykazovaly expresi proteinu tdTomato výhradně ve svrchních vrstvách pokožky, čímž byla potvrzena vhodnost upraveného involukrinového promotoru pro cílení genové exprese do diferencovaných keratinocytů. Dále byly úspěšně připraveny transgenní myši exprimující mKlk5. Dvě transgenní linie vykazovaly 6-9 násobnou overexpresi mKlk5 na mRNA i proteinové úrovni v porovnání s wt zvířaty, transgenní mKlk5 byl ovšem za fyziologických podmínek přítomen pouze ve formě neaktivního zymogenu. Transgenní myši byly proto podrobeny dvěma modelům způsobujícím defekty v epidermální bariéře a potenciálně vedoucím aktivaci proteáz. Při modelu atopické dermatitidy a hojení ran...
|
host ::
RSS.