|
|
New aspects of the cell submembrane signaling
Heneberg, Petr ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Bilej, Martin (oponent) ; Folk, Petr (oponent)
2 ABSTRAKT Tato disertace je příspěvkem k objasnění některých mechanismů submembránové signalizace savčích buněk. Hlavní část výzkumů byla provedena na žírných buňkách a bazofilech aktivovaných prostřednictvím vysokoafinitního receptoru pro IgE typu I, FcεRI, anebo membránovým glykoproteinem Thy-1. Jsou popsány nové role aktinového cytoskeletu v signalizaci žírných buněk přes FcεRI a Thy-1. Objev nového transmembránového adaptorového proteinu NTAL - z anglického "non-T cell activation linker" - krátce před započetím zpracovávání teze vedl ke zvýšené pozornosti věnované tomuto proteinu. Byly zjištěny a popsány významné změny v signalizaci žírných buněk s deficiencí v genu kódujícím protein NTAL, podobně též docházelo k výrazným změnám i v žírných buňkách, u kterých byla exprese proteinu NTAL jen snížena či zvýšena. Bylo dokumentováno, že NTAL je rovněž jedním z proteinů fosforylovaným po agregaci glykoproteinu Thy-1 na povrchu žírných buněk. Velká pozornost byla věnována časoprostorové distribuci glykoproteinu Thy-1 na různých úrovních rozlišení, přičemž byly zkoumány i některé biochemické charakteristiky buněk aktivovaných právě přes Thy-1 glykoprotein. V žírných buňkách a bazofilech byla zjišťována přítomnost dosud neznámých nereceptorových proteinových tyrosinových fosfatáz a následně byla provedena...
|
|
| |
|
|
Dual role of CD9 protein in mast cell activation
Machyna, Martin ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Žírne bunky sú známe efektorové bunky imunitného systemu. Ich účasť bola preukázaná v takých dôležitých procesoch ako sú obrana hostiteľa pred baktériami, toxínmi alebo parazitmi. Niekedy však môžu vytvárať neprimeranú reakciu proti neškodným antigénom v našom prostredí a spôsobovať tak alergie. Je práve preto vrcholne dôležité pochopiť signálne deje, ktoré vedú k aktivácii týchto buniek, za účelom vyvýjania nových stratégii liečby. Novovytvorená potkania monoklonálna protilátka izotypu IgG1, špecifická proti myším žírnym bunkám, bola charakterizovaná ako vhodná pre použitie v prietokovej cytometrii, imunoznačení a imunoprecipitácii. Použitie optimalizovaného postupu imunoizolácie v spojení s hmotnostnou spektrometriou umožnilo identifikovať CD9 ako jej cieľový proteín. CD9 je členom rozsiahlej rodiny nazývanej "tetraspanins". Funkčné štúdie ukázali, že väzba tejto protilátky na žírne bunky spôsobila degranuláciu a aktiváciu včasných dejov ako sú zvýšená tyrozínová fosforylácia a zvýšená hladina voľného cytoplazmatického vápnika. Prekvapivé bolo zistenie že, následná aktivácia týchto buniek cez agregáciu FcεRI receptoru pomocou antigénu viedla naopak ku zníženej degranulácii, vápnikovej odpovedi a tyrozínovej fosforylácii niekoľkých substrátov. Anti-CD9 protilátka však neinhibovala tieto bunkové odpovede,...
|
|
|
FcεRI and Kit signal to actin cytoskeleton via different pathways
Šimíček, Michal ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Drbal, Karel (oponent)
Žírné buňky jsou klíčovými hráči na poli vrozené imunity. V minulosti byly tyto buňky zmiňovány zejména jako iniciátory alergických a zánětlivých reakcí. Současné poznatky ovšem naznačují jejich významnou roli též v boji proti bakteriím a virům. Nyní se navíc ukazuje unikátní postavení žírných buněk v regulaci adaptivní složky imunity. Z těchto důvodů je velmi důležité důkladné pochopení signálních dějů vedoucích k diferenciaci, lokalizaci a aktivaci žírných buněk. Poznání může ve výsledku vést k vývoji nových terapeutických přístupů. Stimulace povrchových receptorů žírných buněk, FcεRI a Kit, vede k fosforylaci transmembránového adaptorového proteinu NTAL a mimo jiné k rozprostírání žírných buněk na extracelulární matrix. Morfologické studie žírných buněk postrádajících protein NTAL odhalily výrazně snížené rozprostírání těchto buněk na fibronektinu po stimulaci Ag a kombinací Ag a SCF. Následná kvantifikace plochy pokryté buňkou a dalších morfologických parametrů potvrdila předchozí pozorování. Tento fenomén byl doprovázen poruchami v polymeraci actinu. Po blokaci integrínů specifickými protilátkami nebyly pozorovány poruchy v adhezi buněk bez exprese proteinu NTAL po aktivaci Ag nebo SCF. Pozorované defekty v buněčném rozprostírání tak byly pravděpodobně z důvodu pozměněné signalizace k...
|
|
|
Functional analysis of syntaxin 16 phosphorylation using yeast as a model
Volfová, Barbora ; Entlicher, Gustav (vedoucí práce) ; Dráber, Petr (oponent)
3 Abstrakt Mechanismus fúze intracelulárních membrán v eukaryotických buňkách zahrnuje několik skupin proteinů, včetně rodiny receptorů pro záchytný protein rozpusného N-ethylmaleinimid-senzitivního-faktoru (SNARE) a Sec1/Munc-18 příbuzných proteinů (SM proteinů). Je známo, že transport v buňkách je evolučně konzervovaný od kvasinek po člověka. Proto pro usnadnění výzkumu, můžeme použít jednoduché eukaryotní buňky Saccharomyces cerevisiae. Savčí SNARE protein syntaxin 16 má známý funkční kvasinkový homolog, protein Tlg2p, který byl použit v této studii jako model pro studium vlivu fosforylace na funkci syntaxinu 16. Také jejich vazebné partnery, SM proteiny mVps45p (savčí) a kvasinkový Vps45p, jsou homologní. Fosforylace SNARE proteinů je známá jako možný způsob regulace fúze membrán. Odstranění jednoho z možných fosforylačních míst na Tlg2p - serinu 90 významně ovlivňuje exocytické a endocytické pochody. Práce prezentovaná v této studii ukazuje některé fenotypy mutant založených na tomto fosforylačním místě proteinu Tlg2p. Těmi mutantami jsou S90A (nefosforylovatelná - mutace serinu na alanin) a S90D (fosfomimetická - mutace serinu na asparagovou kyselinu - kyselá karboxylová skupina napodobuje fosfátovou skupinu). Bylo zjištěno, že fosforylace proteinu Tlg2p na serinu 90 neboli mutace Tlg2p- S90D může...
|
|
|
Regulační úlohy proteinů PAG a CSK v FcɛRI signalizaci žírných buněk
Potůčková, Lucie ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Šebo, Peter (oponent) ; Holáň, Vladimír (oponent)
9 2 ABSTRAKT (CZ) Tato disertační práce je zaměřena především na pochopení regulační úlohy C- terminální Src kinázy (CSK) a proteinu asociovaného s mikrodoménami bohatými na glykosfingolipidy (PAG) v FcɛRI zprostředkované signalizaci myších žírných buněk. FcɛRI aktivace je zahájena agregací receptoru komplexem multivalentního antigenu s IgE a následnou aktivací protein tyrozin kináz, protein tyrozin fosfatáz a dalších molekul signální transdukce. Signalizační děje vedou k degranulaci žírných buněk a uvolnění prozánětlivých mediátorů zodpovědných za vznik alergických onemocnění. Poznání funkce klíčových regulačních molekul, které kontrolují FcɛRI zprostředkovanou aktivaci, degranulaci a cytokinovou produkci žírných buněk, může mít terapeutický dopad. CSK je hlavním negativním regulátorem protein tyrozin kináz z rodiny Src (SFK), které hrají kritickou úlohu v různých imunoreceptorových dějích. Funkce CSK v žírných buňkách však není zcela objasněna. Předpokládá se, že CSK lokalizovaná v cytoplazmě je translokována do blízkosti membránově vázaných SFK s využitím membránových adaptorových proteinů a PAG byl hlavním kandidátem. Pro určení úlohy proteinů CSK a PAG v FcɛRI signalizaci jsme jako model použili žírné buňky odvozené z kostní dřeně (BMMC) myší divokého typu nebo myší deficientních v proteinu PAG...
|
|
| |
|
|
Topografie signalizačních molekul na plazmatické membráně při aktivaci žírných buněk
Lebduška, Pavel ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Šebo, Peter (oponent) ; Benada, Oldřich (oponent) ; Tučková, Ludmila (oponent)
|išitmezirůznýmimodeloými zástupcidanéhobuněčnéhotypu.Prezentovaná metodaizolacemembriínoýchlistuz neadherentníchbuněkby mohlavýzkum v tomtooboruusnadnit.Je všaktřebapřipomenout,Žeplastickéhoobrazuo přenosu signálupřesp|azmatickoumembrá'nujemožnodosáhnoutjensouhrouřady rozdilnýchavzájemněse doplňujícíchpřístupů. Závérv By|y vytvořeny tři způsobyizolacemembránových|istůz neadherentních žírnýchbuněk BMMC. Jedenz nich,založenýna adsorpci leukocytů ke sk|eněnémupovrchu,seukázal být zvláštěslibný a poskyt|řadu vědeckých dzt (čIánekE"). Aktivace žírnýchbuněk RBL dimerizacíreceptoruFceRI vedla k obohacení plazmatickémembrány o adaptoroý protein Grb2, který však'na rozdí| od případumultimerizacer€ceptoru' s FcaRI signiíikantněneko|oka|izoval a distribuceFceRI neby|ametodouimunoznačenímembránových|istů odlišitelnáod distribuce na neaktivovanýchbuňkách (čtánekA).Žírnébuňky BMMC' na rozdí|od buněk RBL' netvořily po mu|timerizacireceptoruvětší agregátyFceRI, nežbuňky neaktivované.Mu|timerizace receptoruFcaRI vedla u buněk BMMC a RBL k jeho internalizaci o srovnate|néintenzitěi celkové dynamice,ale lolcilní redistribuceFceRI se u nich zásadně|iši|a(článekE). Vžifýmode|rozsáhlých (přib|ižně200nm) signalizačníchdoméntohoto receptorubyl zpochybněn. Adaptorový protein NTAL by| v p|azmatickémembráně distribuován v...
|
|
|
Multiple regulatory roles of the transmembrane adaptor protein NTAL in gene transcription and mast cell physiology
Polakovičová, Iva ; Dráber, Petr (vedoucí práce) ; Vyklický, Ladislav (oponent) ; Hašek, Jiří (oponent)
(CZ) Tato dizertační práce se zaměřuje především na pochopení regulačních úloh transmembránových adaptorových proteinů NTAL ("non-T cell activation linker") a PAG ("phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains") v aktivaci myších žírných buněk. V odborné literatuře existují protikladné studie o úloze proteinu NTAL v aktivační dráze vysoce afinního receptoru pro imunoglobulin E (IgE) (FcεRI). Studie prováděné na žírných buňkách připravených z myší s genovým knockoutem NTALu naznačují, že NTAL je negativní regulátor FcεRI signalizace, zatímco experimenty provedené na lidských žírných buňkách a buňkách bazofilní leukemie potkana s potlačenou expresí proteinu NTAL mu připisují pozitivní regulační roli. Abychom pochopili zapojení proteinu NTAL v FcεRI zprostředkované signalizaci v myších žírných buňkách a určili, zda různé metodiky delece NTALu mají různé fyziologické následky, použili jsme široké spektrum testů. Jako model jsme použili žírné buňky odvozené z kostní dřeně (BMMC) a připravili jsme BMMC z myší NTAL divokého typu ("wild type") a myší s genovým knockoutem NTALu. Pomocí lentivirových vektorů jsme transdukovali část buněk divokého typu vektorem nesoucím NTAL shRNA ("short hairpin RNA") pro generování buněk s potlačenou expresí NTALu ("knockdown") nebo prázdným...
|
|
| |
host ::
RSS.