|
|
Příprava geneticky manipulovaných producentů hybridních manumycinů
Krýslová, Dita ; Petříčková, Kateřina (vedoucí práce) ; Doubravová, Linda (oponent)
Bakterie rodu Streptomyces se řadí mezi největší producenty sekundárních metabolitů mezi mikroorganismy. Těchto sekundárních metabolitů produkují celou řadu, významnou skupinou jsou manumycinová antibiotika. Tato antibiotika patří do skupiny polyketidových látek. Zatímco antibiotický účinek u nich není příliš významný, ostatní biologické vlastnosti mají naopak velký potenciál v léčbě zánětů, nádorů apod. Skládají se z hlavní centrální jednotky, ke které jsou připojeny dva polyketidové řetězce, horní a spodní. Na konci spodního polyketidového řetězce je většinou připojená tzv. C5N jednotka. Tato práce vychází především z antibiotika objeveného naší laboratoří, colabomycinu E. Toto antibiotikum je novým členem metabolitů manumycinového typu produkovaných Streptomyces aureus SOK1/5-04. Na základě předchozích výzkumů a popisu jednotlivých genů v genovém klastru colabomycinu E, byla vznesena otázka, zda by nebylo možné vylepšit biologickou aktivitu připojením jiné než C5N jednotky, konkrétně jednotky pocházející z aminokumarinového antibiotika novobiocinu. 4,7-dihydroxykumarinová jednotka novobiocinu je farmakofor, nositel kancerostatické aktivity. Výsledný hybridní metabolit by mohl mít ve srovnání s colabomycinem E posílenou kancerostatickou aktivitu. Za připojení C5N jednotky ke spodnímu...
|
|
| |
|
|
Studie fosforylace anorganické pyrofosfatázy Streptococcus pneumoniae
Štechová, Michaela ; Doubravová, Linda (vedoucí práce) ; Svobodová, Jaroslava (oponent)
Lidský patogen Streptococcus pneumoniae kóduje jednu jedinou Ser/Thr proteinkinázu eukaryotického typu nazvanou StkP. StkP reguluje virulenci, kompetenci, rezistenci ke stresům, genovou expresi a hraje roli v regulaci cyklu buněčného dělení. Analýza fosfoproteomových map divokého kmene S. pneumoniae a mutantního kmene stkP ukázala, že StkP fosforyluje několik pravděpodobných substrátů in vivo, včetně Mn-dependentní anorganické pyrofosfatázy PpaC. Prostřednictvím analyzy hmotnostní spektrometrií byla v aktivním místě proteinu identifikována dvě fosforylovaná místa. Pyrofosfatázy jsou esenciální enzymy, které katalyzují hydrolýzu anorganického pyrofosfátu produkovaného během různých biosyntetických reakcí využívajících ATP. Bylo prokázáno, že změny v pyrofosfatázové aktivitě mají velký efekt na buněčný metabolizmus, růst a dělení bakterií. Cílem této práce bylo studium fosforylace anorganické pyrofosfatázy PpaC v S. pneumoniae. Gen ppaC byl klonován, exprimován v E. coli a protein PpaC byl izolován afinitní chromatografií. Fosforylace PpaC prostřednictvím StkP byla testována kinázovou reakcí, ale nepotvrdili jsme, že PpaC je přímým substrátem StkP in vitro. Dále jsme připravili řadu mutantů v genu ppaC. Dvě pravděpodobné fosfoaminokyseliny identifikované hmotnostní spektrometrií jsme vyměnili za neutrální...
|
|
| |
|
| |
|
|
Spr0334, nový protein buněčného dělení u Streptococcus pneumoniae.
Štekerová, Nela ; Doubravová, Linda (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Spr0334, nový protein buněčného dělení u Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae je významný lidský patogen. Tato bakterie kóduje ve svém genomu jediný gen pro serin/threoninovou proteinkinasu eukaryotního typu nazvanou StkP. StkP reguluje mnoho fyziologických procesů, jako např. patogenezi, kompetenci pro genetickou transformaci, rezistenci k různým druhům stresů a rezistenci k antibiotikům. Rovněž ovlivňuje transkripci celé řady genů účastnících se biosyntézy buněčné stěny, pyrimidinového metabolizmu, oprav DNA a příjmu železa. Současné studie ukázaly, že StkP je lokalizována v buněčné přepážce a významným způsobem reguluje buněčné dělení a morfologii. Mezi její substráty patří mimo jiné proteiny buněčného dělení DivIVA, FtsZ a FtsA. Porovnáním fosfoproteomových map divokého kmene a kmene ΔstkP S. pneumoniae bylo prokázáno, že StkP in vivo fosforyluje několik substrátů, mezi něž patří i membránový protein Spr0334. Hmotnostní spektrometrií byla určena místa fosforylace proteinu Spr0334, a to threonin 67 a threonin 78. Dále bylo zjištěno, že je protein Spr0334 lokalizován v buněčné přepážce, což vedlo k hypotéze, že by mohl být dalším proteinem buněčného dělení u S. pneumoniae. Hlavním záměrem této diplomové práce bylo přiblížit funkci neznámého proteinu Spr0334 u S. pneumoniae a zjistit vliv...
|
|
|
Regulace penicilin vazebného proteinu Pbp2a u Streptococcus pneumoniae
Kubeša, Bohumil ; Doubravová, Linda (vedoucí práce) ; Pospíšil, Jiří (oponent)
Regulace penicilin vazebného proteinu Pbp2a u Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae je extracelulární lidský patogen, který ve svém genomu kóduje unikátní Ser/Thr proteinkinasu eukaryotického typu StkP. Tento enzym se prostřednictvím fosforylace svých substrátu podílí zejména na regulaci buněčného dělení a syntéze buněčné stěny. Transmembránový protein MacP byl identifikován jako substrát proteinkinasy StkP. Jedná se o aktivátor penicilin vazebného proteinu PBP2a, který se svou transpeptidasovou a transglykosylasovou aktivitou podílí na syntéze peptidoglykanu. Zjistili jsme, že MacP je fosforylován proteinkinasou StkP v pozicích T32 a T56. Potvrdili jsme, že MacP a PBP2a vzájemně interagují a fosfoablativní ani fosfomimetické mutace majoritních fosforylovaných zbytků proteinu MacP nemají vliv na interakci s PBP2a a neovlivňují zásadně ani funkci MacP in vivo. Dále se nám podařilo dokázat, že delece macP je synteticky letální s delecí pbp1a, čímž jsme potvrdili, že je MacP aktivátorem proteinu PBP2a. MacP je lokalizován v buněčné přepážce a interaguje s řadou proteinů buněčného dělení S. pneumoniae. Klíčová slova: Streptococcus pneumoniae, buněčné dělení, MacP, PBP2a, fosforylace
|
|
|
Ser/Thr proteinkinázy u mykobakterií
Borovcová, Taťána ; Doubravová, Linda (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Mycobacterium tuberculosis kóduje 11 Ser/Thr proteinkináz. Tyto proteinkinázy jsou strukturně příbuzné eukaryotickým proteinkinázám. Fosfoproteom obsahuje stovky proteinů fosforylovaných na Ser/Thr zbytcích, které ovlivňují všechny aspekty biologie buňky, což podporuje kritickou roli fosforylace na regulaci fyziologie. Důležitou roli na regulaci mají zejména proteinkinázy PknA, PknB, PknG a PknL, tyto proteinkinázy se vyskytují u všech druhů mykobakterií. Pro M. tuberculosis jsou však esenciální pouze PknA a PknB, které regulují tvar buňky, skrze regulaci syntézy buněčné stěny, a buněčné dělení. Další důležitou proteinkinázou je PknG, která ač není esenciální pro růst, je nezbytná pro virulenci, jelikož podporuje přežití patogenu uvnitř makrofágů hostitele. Ser/Thr proteinkinázy proto představují zajímavý cíl pro výzkum inhibitorů využitelných pro léčbu tuberkulózy.
|
|
|
Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae
Holečková, Nela ; Doubravová, Linda (vedoucí práce) ; Lichá, Irena (oponent) ; Petříčková, Kateřina (oponent)
Analýza signální dráhy proteinkinasy StkP u Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumonaie je nejen významný lidský patogen, ale také vhodný modelový organismus ke zkoumání buněčného dělení u ovoidních bakterií. Tato bakterie postrádá oba systémy výběru místa buněčného dělení Min a NO, a tedy mechanismus, jakým určuje místo, ve kterém nastane buněčné dělení, je neznámý. Navíc ve svém genomu kóduje jedinou serin/threoninovou proteinkinasu eukaryotického typu nazývanou StkP a jedinou serin/threoninovou proteinfosfatasu PP2C typu nazývanou PhpP. StkP je jedním z hlavních regulátorů buněčného dělení a pravděpodobně ovlivňuje průběh buněčného dělení i fosforylací svých substrátů, mezi které mimo jiné patří proteiny buněčného dělení FtsZ, FtsA, DivIVA, MacP, Jag/KhpB/EloR a LocZ/MapZ. První projekt této disertační práce se zabývá určením funkce proteinu LocZ v rámci buněčného dělení. Souhrnně, locZ sice není esenciální, ale účastní se procesu výběru místa dělení u S. pneumoniae a naše výsledky napovídají, že patří mezi pozitivní regulátory umístění Z-kruhu. Buňky s deplecí LocZ jsou schopny tvořit Z-kruh, ale ten je prostorově špatně umístěn, což má za následek defekty v buněčném dělení, deformity buněčného tvaru a tvorbu nerovnoměrně rozdělených dceřiných buněk, které občas neobsahují žádnou DNA. LocZ má...
|
|
| |
host ::
RSS.