|
|
Analýza kotranskripčního sestavování spliceosomu na RPL22B
Hájková, Karolína ; Abrhámová, Kateřina (vedoucí práce) ; Cvačková, Zuzana (oponent)
Proces sestřihu slouží v eukaryotních organismech k odstranění nekódujících sekvencí, intronů, z transkriptů za vzniku mRNA, a společně s transkripcí umožňuje regulovat také množství vzniklé RNA, která bude využita dále v translaci. Předmětem zájmu našeho studia je protein Rpl22, který váže intron vlastního transkriptu i svého paralogu a dokáže inhibovat jejich sestřih. Tato diplomová práce se zabývá mechanismem, jakým inhibice probíhá, a přináší nové informace o regulaci exprese transkriptu RPL22 skrze jeho intron. S využitím analýzy kotranskripčního sestavování spliceosomu na transkriptu RPL22B jsme mohli pozorovat, že rozpoznání sestřihových míst komponentami U1 snRNP, Msl5 a Mud2, není inhibicí ovlivněno. K inhibici sestřihu RPL22B tedy bude docházet později během sestavování spliceosomu či během aktivace spliceosomu, před proběhnutím prvního kroku sestřihu.
|
|
| |
|
|
Functional analysis of hPrp8 mutations linked to retinitis pigmentosa.
Matějů, Daniel ; Cvačková, Zuzana (vedoucí práce) ; Král, Vlastimil (oponent)
hPrp8 je esenciální faktor účastnící se sestřihu pre-mRNA. Tento vysoce konzervovaný protein je součástí U5 malé jaderné ribonukleoproteinové částice (U5 snRNP), která představuje jednu ze základních komponent spliceozomu. hPrp8 působí jako klíčový regulátor aktivace spliceozomu a interaguje přímo s U5 snRNA a s oblastmi pre-mRNA, které se účastní transesterifikačních reakcí během sestřihu. Mutace v hPrp8 způsobují autozomálně dominantní formu retinitis pigmentosa (RP), dědičného onemocnění, které vede k postupné degeneraci sítnice. V této práci jsme zkoumali, jak mutace spojené s RP ovlivňují funkci proteinu hPrp8. Použili jsme metodu 'BAC recombineering' k vytvoření mutovaných variant hPrp8-GFP a připravili jsme stabilní buněčné linie exprimující tyto rekombinantní proteiny. Mutované proteiny byly exprimovány a lokalizovány do jádra, avšak jedna z bodových mutací výrazně ovlivnila lokalizaci a stabilitu hPrp8. Další experimenty napověděly, že mutace spojené s RP ovlivňují schopnost hPrp8 interagovat s dalšími komponenty U5 snRNP a s pre-mRNA. Dále jsme studovali biogenezi U5 snRNP komplexů. Pomocí siRNA jsme odstranili hPrp8 a narušili tak formování U5 snRNP komplexu. Zjistili jsme, že nekompletní U5 snRNP komplexy se hromadí v Cajalových tělískách, což značí, že tyto jaderné struktury hrají roli...
|
|
|
Changes in domain organization of the plasma membrane in the stress response
Vaškovičová, Katarína ; Malínský, Jan (vedoucí práce) ; Zimmermannová, Olga (oponent) ; Cvačková, Zuzana (oponent)
MCC/eisosomy jsou mikrodomény kvasinkové plasmatické membrány. MCC/eisosomy vnímají změny extracelulárních a intracelulárních podmínek a aktivují důležité signální dráhy, které odpovídají na stres. V této studii jsme zkoumali funkci MCC/eisosomů za podmínek chronického nedostatku glukózy. Ukázali jsme, že za těchto podmínek MCC/eisosomy regulují degradaci mRNA. Konkrétně, sekvestrace evolučně konzervované exoribonukleázy Xrn1 na MCC/eisosomech vede ke snížení její enzymatické aktivity. Modulace enzymatické aktivity pomocí lokalizace enzymu může představovat nový a efektivní způsob regulace biochemických drah. Naše výsledky také naznačují, že MCC protein Nce102 může hrát úlohu ve fúzi vakuol a v degradaci lipidových partikulí. Odhalili jsme, že dlouhodobý nedostatek glukózy indukuje translokaci proteinu Nce102 z MCC mikrodomény do vakuolárních membránových mikrodomén bohatých na steroly. Mutanty, kterým chybí protein Nce102 a jeho funkční homolog Fhn1, vykazují signifikantní zpoždění v maturaci vakuol a v turnoveru markeru lipidových partikul, proteinu Erg6. Funkce MCC/eisosomů v stresové odpovědi jsou zdokumentované ve velkém množství kvasinkových druhů. Podobně jako funkce těchto mikrodomén jsou i jednotlivé proteinové komponenty MCC/eisosomů evolučně konzervované. Abychom hlouběji...
|
|
|
Doména 1.1 primárního faktoru sigma a nový systém pro expresi RNA polymerázy z Bacillus subtilis.
Kálalová, Debora ; Krásný, Libor (vedoucí práce) ; Cvačková, Zuzana (oponent)
RNA polymeráza (RNAP) je klíčový vícepodjednotkový enzym genové exprese, který spolu s faktorem σ tvoří holoenzym a zajišťuje přepis genetické informace z DNA do RNA. V této práci byla studována RNAP z Bacillus subtilis a její primární faktor σA . Faktor σA určuje specifitu pro promotory, na které holoenzym nasedá. Součástí jeho struktury je doména 1.1, která pravděpodobně vazbou na domény 2 a 4 zabraňuje vazbě samotné σA na promotor, pokud není součástí holoenzymu. První část práce ověřuje hypotézu, zda doména 1.1 váže domény 2 a 4 a brání tak vazbě samotné σA na promotor. Za tímto účelem byly vytvořeny různé doménové konstrukty, u kterých byly testovány vzájemné interakce. Interakce domén byla testována metodami Nitrocellulose filter binding assay, EMSA a transkripcí in vitro. Výsledky neprokázaly významnou interakci mezi doménami. Druhá část práce se věnuje vytvoření nástroje pro studium enzymologie RNAP z B. subtilis - rekombinantní RNAP (rRNAP). Nejprve byl řadou klonovacích kroků vytvořen plazmidový konstrukt pro expresi rRNAP v Escherichia coli, následně byl protein izolován a charakterizován. Izolace se podařila bez kontaminace faktory σ (tato kontaminace je častá při izolaci RNAP z B. subtilis). Byla však zjištěna přítomnost ATP (nikoli GTP) a vazba této molekuly by mohla mít biologickou...
|
|
|
Mechanismus vzniku perinukleárních aktinových mikrofilament a jejich funkce v buněčné motilitě
Votavová, Barbora ; Vomastek, Tomáš (vedoucí práce) ; Cvačková, Zuzana (oponent)
Pohyb jádra, ke kterému dochází během buněčné migrace a invazivity, je aktivní proces z velké části zprostředkovaný aktino-myozinovým cytoskeletem. Klíčovou roli v přenosu aktino-myozinových sil na jádro hraje proteinový komplex LINC, který se skládá z proteinů SUN a nesprin a který mechanicky spojuje jadernou laminu a cytoskelet. Komplex LINC asociuje s tzv. perinukleárními aktinovými vlákny, která jsou jeho pomocí zakotvená v jaderné obálce. Perinukleární aktinová vlákna jsou zakotvena také ve fokálních adhezích a tak mechanicky spojují extracelulární matrix s komplexem LINC a jádrem. Jelikož perinukleární aktinová vlákna jsou kontraktilní, lze předpokládat, že generují síly, které regulují pohyb jádra a tak optimalizují buněčný pohyb. V této práci jsme se zaměřili na roli perinukleárních aktinových vláken během buněčné migrace. Hlavním cílem diplomové práce bylo objasnit mechanizmy, které se podílí na tvorbě perinukleárních aktinových vláken a jak tyto mechanizmy usnadňují migraci buněk. Práce byla zaměřena na charakterizaci úlohy signální dráhy LPA - RhoA při vzniku perinukleárních aktinových vláken, úlohy jednotlivých součástí LINC komplexu v zakotvení aktinových vláken do jaderné obálky a jaký vliv mají tato vlákna na migraci nenádorových a nádorových buněk. Působení LPA bylo potvrzeno jako...
|
|
|
Functional analysis of hPrp8 mutations linked to retinitis pigmentosa.
Matějů, Daniel ; Cvačková, Zuzana (vedoucí práce) ; Král, Vlastimil (oponent)
hPrp8 je esenciální faktor účastnící se sestřihu pre-mRNA. Tento vysoce konzervovaný protein je součástí U5 malé jaderné ribonukleoproteinové částice (U5 snRNP), která představuje jednu ze základních komponent spliceozomu. hPrp8 působí jako klíčový regulátor aktivace spliceozomu a interaguje přímo s U5 snRNA a s oblastmi pre-mRNA, které se účastní transesterifikačních reakcí během sestřihu. Mutace v hPrp8 způsobují autozomálně dominantní formu retinitis pigmentosa (RP), dědičného onemocnění, které vede k postupné degeneraci sítnice. V této práci jsme zkoumali, jak mutace spojené s RP ovlivňují funkci proteinu hPrp8. Použili jsme metodu 'BAC recombineering' k vytvoření mutovaných variant hPrp8-GFP a připravili jsme stabilní buněčné linie exprimující tyto rekombinantní proteiny. Mutované proteiny byly exprimovány a lokalizovány do jádra, avšak jedna z bodových mutací výrazně ovlivnila lokalizaci a stabilitu hPrp8. Další experimenty napověděly, že mutace spojené s RP ovlivňují schopnost hPrp8 interagovat s dalšími komponenty U5 snRNP a s pre-mRNA. Dále jsme studovali biogenezi U5 snRNP komplexů. Pomocí siRNA jsme odstranili hPrp8 a narušili tak formování U5 snRNP komplexu. Zjistili jsme, že nekompletní U5 snRNP komplexy se hromadí v Cajalových tělískách, což značí, že tyto jaderné struktury hrají roli...
|
|
|
Nucleolus and Its Associated Chromatin
Cvačková, Zuzana ; Raška, Ivan (vedoucí práce) ; Smetana, Karel (oponent) ; Nedvídek, Josef (oponent)
Savčí chromosomy zaujímají v jádře buňky tzv. chromosomální teritoria, jejichž umístění je v rámci buněčného jádra nenáhodné. Kontroverzním problémem však zůstává, zda je uspořádání chromosomálních teritorií (respektive chromatinu) zachováno i v dceřinných buňkách. V předkládané práci jsme sledovali zachovávání různých oblastí chromatinu s neznámým složením a také chromatinu, který asociuje s jadérky a jehož významnou část tvoří chromosomy nesoucí ribosomální geny. Vybrané oblasti chromatinu v transfekovaných HepG2 buňkách jsme značili fotokonverzí proteinu H4-Dendra2 a buňky jsme sledovali do následující interfáze. Rozmístění označeného chromatinu v dceřinných buňkách vykazovalo nenáhodný charakter. Toto rozmístění se nicméně ve většině dceřinných buněk významně odlišovalo od původně označeného chromatinu. Chromatin asociovaný s jadérky byl pak přeskupen do blízkosti různých jadérek. Naše výsledky tedy neodpovídají konceptu o zachování chromatinového uspořádání. Tento závěr je podložen též faktem, že se počet jadérek mezi dceřinnými buňkami významně liší. Naše výsledky podporují představu, že zatímco si transfekované dceřinné HepG2 buňky udrží určité rysy chromosomálního uspořádání, je zde přítomen i náhodný prvek, který způsobuje vzájemné přeuspořádání chromosomálních teritorií (respektive chromatinu)....
|
|
| |
host ::
RSS.