|
|
Strukturně-funkční aspekty adenylát cyklázového toxinu z bakterie Bordetella pertussis
Březinová, Karolína ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Brzobohatá, Hana (oponent)
Černý kašel (pertuse) je vysoce infekční onemocnění dýchacích cest, které je způsobeno Gram negativní bakterií Bordetella pertussis. I přesto, že je ve vyspělých zemích proočkovanost populace vysoká, tak pertuse patří mezi nejrozšířenější onemocnění, před kterým se lze bránit očkováním. Bakterie produkuje celou řadu faktorů virulence, které usnadňují proces kolonizace řasinkového epitelu a infekci horních cest dýchacích. Mezi nejdůležitější faktory virulence patří adenylát cyklázový toxin (CyaA). Tento toxin se řadí mezi tzv. RTX (Repeat-In-ToXins) proteiny, které jsou uvolňovány z bakterie pomocí sekrečního aparátu typu 1 (T1SS). CyaA je multifunkční toxin, vykazující jak hemolytickou, tak i cytotoxickou aktivitu. Cytotoxická aktivita toxinu je způsobena N-koncovou adenylyl cyklázovou (AC) doménou, která je napřímo dopravována přes cytoplasmatickou membránu do cytosolu buněk, kde interaguje s kalmodulinem a katalyzuje nekontrolovatelnou přeměnu adenosintrifosfátu (ATP) na cyklický adenosin-3',5'-monofosát (cAMP). Receptorem CyaA toxinu na povrchu buněk je integrinový receptor CD11b/CD18 (známý též jako komplementový receptor typu 3), který se primárně vyskytuje na fagocytujících buňkách hostitelského organismu. Tato práce se zaměřuje na strukturně-funkční aspekty toxinu CyaA a shrnuje poznatky o...
|
|
|
Mechanisms underlying subversion of host immunity by Bordetella pertussis
Klímová, Nela ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent) ; Filipp, Dominik (oponent)
Bordetella pertussis, původce černého kašle (známého také jako dávivý kašel nebo pertuse), je gramnegativní respirační patogen, adaptovaný na člověka. Tato bakterie produkuje řadu faktorů virulence, z nichž adenylátcyklázový toxin (ACT) a pertusový toxin (PT) hrají významnou roli při manipulaci s imunitní odpovědí hostitele v raném katarálním stádiu infekce. Ačkoli oba toxiny uplatňují svou cytotoxickou aktivitu zvyšováním hladiny cAMP uvnitř buněk, liší se od sebe navzájem svou strukturou, mechanismem sekrece i způsobem intoxikace buněk, stejně tak jako svou schopností modulovat hostitelovu adaptivní imunitní odpověď. Cílem této práce bylo definovat vztah mezi strukturou a funkcí ACT, určující mechanismus sekrece ACT sekrečním systémem typu I (T1SS), a dále rozklíčovat imunomodulační vlastnosti ACT a PT v průběhu infekce bakterií B. pertussis. Integrací různých strukturně-biologických přístupů bylo odhaleno, že RTX doména ACT sestává ze souvislého uskupení pěti β-šroubovicových bloků s navázanými Ca2+ ionty, jejichž skládáním během sekrece se vytváří vnitromolekulová Brownovská západka, zabraňující zpětnému vklouznutí sekretovaného polypeptidu do sekrečního kanálu T1SS. Tímto se urychluje sekrece ACT z bakteriálních buněk pomocí směrovaného mechanismu "vytlačování-západka". Experimentální infekce...
|
|
|
Úloha RTX domény v aktivitě adenylátcyklázového toxinu z Bordetella pertussis
Klímová, Nela ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Adenylátcyklázový toxin (CyaA) bakterie Bordetella pertussis je protein sestávající z 1706 aminokyselin, obsahující na svém N-konci enzymatickou adenylátcyklázovou (AC) doménu a na C-konci repetitivní RTX (z angl. Repeat-in-Toxin) doménu. Přítomnost RTX domény řadí CyaA do rodiny tzv. RTX proteinů, sekretovaných z cytosolu gramnegativních bakterií sekrečním aparátem typu I (T1SS). RTX doména CyaA se skládá z pěti bloků nonapeptidových RTX repetic s konsenzuální sekvencí X-(L/I/V)-X-G-G-X-G-X-D. Cílem této práce bylo určit úlohu RTX domény v biologické aktivitě CyaA a její vliv na sekreci toxinu z buněk Bordetella pertussis. Systematická deleční analýza bloků RTX repetic ukázala, že žádná z připravených delečních variant toxinu nebyla schopna translokovat AC doménu přes cytoplazmatickou membránu do cytosolu cílových buněk a tvořit póry v membránách těchto buněk. Odstranění jednotlivých bloků RTX repetic vedlo navíc k nízké efektivitě sekrece mutant do vnějšího prostředí bakterie. Z těchto dat vyplývá, že strukturní celistvost RTX domény CyaA hraje klíčovou úlohu nejen v cytotoxické aktivitě proteinu, ale napomáhá i při jeho sekreci přes T1SS.
|
|
|
Structural mass spectrometry of Bordetella virulence factors
Jurnečka, David ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Novák, Petr (oponent) ; Řehulka, Pavel (oponent)
Bakterie rodu Bordetella jsou aerobní gramnegativní kokobacily, které osidlují dýchací trakt u řady savců a tím způsobují různé druhy respiračních onemocnění. Bakterie produkují velké množství adhesivních molekul a toxinů, které se výrazně podílejí na rozvoji infekce a potlačení hostitelského imunitního systému. Mezi hlavní zástupce patří filamentózní hemaglutinin (FHA), který zajišťuje přilnutí bakterie k řasinkovému epitelu hostitele, a adenylát cyklázový toxin (CyaA), který je schopen potlačit baktericidní aktivitu fagocytů. CyaA, společně s α-hemolysinem (HlyA) z Escherichia coli a RtxA cytotoxinem z druhu Kingella kingae, patří do rozsáhlé skupiny takzvaných Repeats-in-toxin (RTX) cytolysinů/hemolyzinů, které jsou post-translačně modifikovány pomocí acylace konzervovaných lyzinových zbytků. Cílem této práce je strukturně-funkční charakterizace FHA molekul a analýza post-translačních modifikací u RTX toxinů a jejich hybridních variant pomocí hmotnostní spektrometrie. Za prvé, diferenciální izotopické značení 16O/18O odhalilo, že C- koncové aminokyseliny vysoce homologních FHA proteinů z Bordetella pertussis a Bordetella bronchiseptica jsou štěpeny na různých místech, a to v pozici 2348 pro B. pertussis a v pozici 2479 pro B. bronchiseptica. Za druhé, proteomická analýza tryptických fragmentů...
|
|
|
Substrátová specifita histondeacetylas
Ustinova, Kseniya ; Bařinka, Cyril (vedoucí práce) ; Bumba, Ladislav (oponent) ; Obšil, Tomáš (oponent)
Tubulin v buňce podléhá posttranslačním modifikacím, jež vytvářejí funkčně odlišné mikrotubuly a označují je pro specializované funkce. Jednou z takovýchto posttranslačních modifikací je acetylace Lys40 α-tubulinu, která je řízena aktivitou histondeacetylasy 6 (HDAC6). Acetylace Lys40 je charakteristickým znakem stabilních mikrotubulů. Chrání je před mechanickým stárnutím, ovlivňuje pohyblivost buněk, jakož i větvení axonů a stabilizaci dendritů. Tubulin vyniká jako nejvýznamnější fyziologický substrát pro HDAC6. HDAC6 je multidoménovým cytosolickým proteinem podílejícím se na nesčetných buněčných procesech a je slibným cílem léčby rakoviny a neurodegenerativních chorob. Pochopení mechanismů interakce HDAC6 s jeho substráty, zejména s tubulinem, může otevřít cestu pro vývoj nových léčebných strategií využívajících vysoce selektivní inhibitory HDAC6. V této práci jsme zkoumala molekulární podstatu jak HDAC6 rozpoznává tubulin. Naše detailní kinetická analýza ukazuje, že deacetylace volného tubulinu pomocí HDAC6 je 1500krát rychlejší než deacetylace mikrotubulů. Dále jsme ukázali, že na rozdíl od aminokyselin podílejících se na podélných a laterálních interakcích mezi tubulinovými dimery, aminokyseliny flexibilní smyčky obsahující Lys40 (s výjimkou míst P1 a P-1) příliš nepřispívají k rozpoznávání...
|
|
|
Development of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Bordetella pertussis
Brázdilová, Ludmila ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Dráber, Peter (oponent)
Gram-negativní bakterie Bordetella pertussis je pathogen způsobující onemocnění zvané pertuse nebo černý kašel. Infekce je zvláště nebezpečná pro kojence a pokud není léčena, může být pro ně až smrtelná. Po zavedení acelulární pertusové vakcíny místo celobuněčné dochází k nárůstu případů onemocnění a pertuse je v rozvinutých zemích nejrozšířenější nemoc, jíž lze předejít očkováním. Z toho důvodu je důležitý vývoj nové generace vakcín a stoupá i důležitost metod vyhodnocujících účinnost vakcín. Měření opsonofagocytických procesů je jedna z metod využívaná k vyhodnocení odpovědi na vakcinaci. Hlavní cíl této práce je vývoj opsonofagocytických testů, které měří pohlcení částic a zabíjení mikroorganizmů pro měření funkčních vlastností protilátek proti Bordetella pertussis. Myší a lidské neutrofily byly izolovány třemi různými metodami, jejich opsonofgocytická aktivita byla porovnána a byly použity pro zhodnocení lidských a myších sér v opsonofagocytických testech. Různé experimentální podmínky opsonofagocytických testů byly testovány, včetně různých poměrů fagocytických buněk k bakteriálním buňkám a různých ředění sér. Opsonofagocytický test rozlišil naivní od imunizovaného séra. Sérum z myší vakcinovaných celobuněčnou vakcínou zvýšilo účinnost fagocytózy, kdežto to z myší vakcinovaných acelulární...
|
|
|
Úloha RTX domény v aktivitě adenylátcyklázového toxinu z Bordetella pertussis
Klímová, Nela ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Adenylátcyklázový toxin (CyaA) bakterie Bordetella pertussis je protein sestávající z 1706 aminokyselin, obsahující na svém N-konci enzymatickou adenylátcyklázovou (AC) doménu a na C-konci repetitivní RTX (z angl. Repeat-in-Toxin) doménu. Přítomnost RTX domény řadí CyaA do rodiny tzv. RTX proteinů, sekretovaných z cytosolu gramnegativních bakterií sekrečním aparátem typu I (T1SS). RTX doména CyaA se skládá z pěti bloků nonapeptidových RTX repetic s konsenzuální sekvencí X-(L/I/V)-X-G-G-X-G-X-D. Cílem této práce bylo určit úlohu RTX domény v biologické aktivitě CyaA a její vliv na sekreci toxinu z buněk Bordetella pertussis. Systematická deleční analýza bloků RTX repetic ukázala, že žádná z připravených delečních variant toxinu nebyla schopna translokovat AC doménu přes cytoplazmatickou membránu do cytosolu cílových buněk a tvořit póry v membránách těchto buněk. Odstranění jednotlivých bloků RTX repetic vedlo navíc k nízké efektivitě sekrece mutant do vnějšího prostředí bakterie. Z těchto dat vyplývá, že strukturní celistvost RTX domény CyaA hraje klíčovou úlohu nejen v cytotoxické aktivitě proteinu, ale napomáhá i při jeho sekreci přes T1SS.
|
|
|
Mechanismus sekrece adenylát cyklázového toxinu Bordetella pertussis pomocí sekrečního aparátu typu I (TISS)
Klímová, Nela ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Konopásek, Ivo (oponent)
Sekreční aparát typu I gramnegativních bakterií umožňuje transport proteinů z cytoplasmy do extracelulárního prostoru přes vnitřní i vnější membránu v jednom kroku. Transmembránový kanál je složen pouze ze tří proteinů - ATPázy ve vnitřní membráně, fúzního proteinu a specifického proteinu ve vnější membráně. Tato práce podává přehled současných znalostí o struktuře tohoto sekrečního aparátu, formování komplexu v membráně a o mechanismu sekrece proteinu. Zdůrazněna je role sbalování proteinu na sekreci. Dále je nastíněna charakteristika substrátů sekrečního aparátu typu I, se zaměřením na adenylátcyklázový toxin bakterie Bordetella pertusis, původce černého kašle.
|
|
|
Adenylátcyklázový toxin Bordetella pertussis jako marker pro studium endocytózy komplementového receptoru CD11b/CD18.
Chvojková, Věra ; Bumba, Ladislav (vedoucí práce) ; Černý, Jan (oponent)
Bordetella pertussis způsobuje u lidí infekční onemocnění nazývané černý kašel. Tato gram-negativní bakterie produkuje adenylátcyklázový toxin (CyaA), který se váže na integrinový receptor CD11b/CD18 na povrchu myeloidních fagocytů a dopravuje do jejich cytosolu adenylátcyklázovou doménu (AC). Tato práce se zabývá studiem endocytózy CyaA a jeho využití jako specifické značky při studiu endocytické dráhy CD11b/CD18 receptoru. Detoxifikovaná verze toxinu, CyaA-AC- , jenž je schopna zvyšovat intracelulární koncentraci vápenatých iontů a zároveň umožňuje únik draselných iontů z buňky, způsobuje aktivaci integrinového receptoru CD11b/CD18, což vede k následné endocytóze prostřednictvím dráhy závislé na klatrinu. Na druhou stranu, inaktivní mutanta CyaA-KP-AC- nespouští aktivaci receptoru a je endocytována prostřednictvím jiné dráhy, která je na klatrinu nezávislá. Tyto data naznačují, že mechanismus endocytózy CD11b/CD18 je určován a regulován odlišnými konformačními stavy tohoto receptoru.
|
|
| |
host ::
RSS.