|
|
Studium produkce extracelulárních polymerů pomocí mikroorganismu Aureobasidium pullulans
Horáček, Pavel ; Breierová, Emília (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Diplomová práce se zabývá studiem vlivu podmínek a kultivačního uspořádání na produkci extracelulárních polymerů pomocí kvasinkovitého mikroorganismu Aureobasidium pullulans. Obsahem teoretické části je stručná charakterizace A. pullulans, jeho použití v biotechnologiích a přehled produkovaných látek, zejména pullulanu a kyselině poly-L-jablečné. Náplní experimentální části práce bylo zjištění nejvhodnějších podmínek kultivace A. pullulans CCM 8182. Zjištěné optimální podmínky byly srovnány s průběhem kultivací na odpadních substrátech, které představují levné zdroje živin a umožňují snížení nákladů výroby. Z odpadních substrátů byly použity například ovesné otruby, pohankové slupky, jablečná vláknina a další. Součástí experimentální práce byla optimalizace stanovení obsahu extracelulárních polymerů – pullulanu a kyseliny poly-L-jablečné metodou HPLC. V rámci optimalizace byla navržena vhodná mobilní fáze a podmínky separace produktů hydrolýzy polymerů, tj. glukózy a kyseliny L-jablečné na speciální stacionární fázi (kolona Rezex Roa organic acid H+, 5 mM kyselina sírová, průtok 0,5 mL/min, teplota 60 °C). K nejvyšší produkci pullulanu došlo při kultivaci na ovesných otrubách (13,03 g/L) při počátečním pH 7,5, zatímco nejvyšší produkce kyseliny poly-L-jablečné byla zaznamenána u kultivace na jablečných slupkách (2,89 g/L) při pH 6. Bylo zjištěno, že k vyšší produkci kyseliny poly-L-jablečné došlo při pH 6, zatímco vyšší produkce pullulanu byla při pH 7,5.
|
|
|
Partial purification and characterization of polygalacturonases of Geotrichum candidum.
Jäger, Jakub ; Breierová, Emília (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
This work discusses the possibilities of using microbial degradation of grape pomace, main waste material from wine production, to preparate industrially important enzymes. The issue is focused on the production of pectolytic enzymes, particularly polygalacturonase, by Geotrichum candidum CCY 16-1-29 via solid state fermentation on grape pomace. The theoretical part of the bachelor thesis focuses on studying plant cells and saccharides from which the plant cell wall is made of, mainly pectin. Cell wall sacharides were used as a carbon source for solid state fermentation (SSF) and pectin as an inductor of pectolytic enzymes. This bachelor thesis also deals with the enzymatic degradation of cell wall polysacharides. The greatest attention is paid to degrade pectin and pectolytic enzyme function. Production of pectolytic enzymes is mentioned subsequently. The last chapter from the theoretical part is dedicated to technical use of pectolytic enzymes. In the experimental part of this work I deal with the partial purification and characterization of majority polygalacturonase produced on the seventh day of cultivation, when another increase of extracellular polygalacturonase activity occurred. The yield of cultivation was 43,5 mg of protein extract /100 g of grape pomace. The extract contained protein, and its activity was lyophilisate. Its specific activity was protein. The enzyme was produced in at least four forms differing in pH optimum (4,0; 4,4; 4,8; 5,2). The pH optimum for majority polygalacturonase was 4,8. Action pattern of this enzyme determined as the dependence of polymeric substrate viscosity decrease on its degradation showed that the enzyme is a typical polygalacturonase with random action pattern (EC 3.2.1.15).Value of Km reached indicating a high affinity for this substrate. The amino acid sequence "SNNVVSNVNILSSQVVNSDNGVR" obtained by mass spectrometry after SDS-PAGE and tryptic digestion, was identified as a stretch of primary structure of polygalacturonase of Ap2PG1 G. candidum based on the comparison with proteins from the Uniprot database. It shows the highest similarity with other polygalacturonases of G. candidum S31PG1, S31PG2 and G. klebahnii PSE3. On the basis of this similarity to enzymes produced by phytopathogenic strains of G. candidum and the fact that this enzyme was not produced only in the early stages of cultivation, it can be assumed, that the strain of G. candidum CCY 16-1-29 acted also as a phytopathogenic strain.
|
|
|
Extracelulární enzymové aktivity půdních kvasinek
Pavlatovská, Barbora ; Breierová, Emília (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Předložená práce se zabývá schopností kvasinek, izolovaných z půdy pod ovocnými stromy a z kontaminované půdy oblasti Pernek jihozápadního Slovenska, produkovat extracelulární enzymové aktivity. Celkem bylo screeningu podrobeno 68 kmenů kvasinek náležících k 45 různým druhům a testována byla schopnost produkce polygalakturonáz, lipáz, celuláz, proteáz, -glukosidáz, -amyláz a schopnost tvorby škrobu podobného polysacharidu. V rámci diplomové práce byla také provedena optimalizace metody pro stanovení chitinázové aktivity u kvasinek. Testována byla vhodnost celkem čtyř metod využívající jednak kultivaci na pevném tak v kapalném médiu. Zároveň byla prověřena vhodnost koloidního a nerozpustného chitinu pro kultivaci kvasinek. Jako nejvhodnější byla vyhodnocena kultivace kvasinek v kapalném médiu s koloidním chitinem a následná detekce chitinázové aktivity Ehrlichovým testem. Tato metoda byla posléze použita pro stanovení extracelulární chitinolytické aktivity všech 68 kmenů kvasinek. Více jak 75 % testovaných kvasinek vykazovalo alespoň jednu enzymatickou aktivitu a pouze deset kmenů bylo zcela enzymaticky neaktivních. Nejčastěji produkovanými enzymy byly extracelulární lipázy, proteázy a -glukosidázy a naopak méně častá byla produkce chitináz a celuláz. Širší spektrum enzymatických aktivit vykazovaly kvasinky izolované z půdy pod ovocnými stromy než kvasinky z kontaminovaných půd. Největší produkce extracelulárních enzymů byla pozorována u Aureobasidium pullulans, CCY 27-1-134, který vykazoval všechny testované aktivity, ale neprodukoval polysacharid podobný škrobu. Druhými největšími producenty byly druhy Cystofilobasidium macerans a Tausonia pullulans. Navíc tyto druhy vykazovaly vnitrodruhovou variabilitu v produkci lipáz a polygalakturonáz. Zástupci rodu Cryptococcus byli nejčastěji producenty lipáz, -amyláz a -glukosidáz, ale schopnost produkce jednotlivými kmeny se poměrně výrazně lišila. Pro všechny testované kmeny rodu Galactomyces byla stanovena produkce polygalakturonáz a všechny kmeny rodu Candida a Cyberlindnera produkovaly -glukosidázy. Pro všechny kmeny druhu Galactomyces candidum (CCY 16-3-2, 16-3-4, 16-3-6), Galactomyces pseudocandidus (CCY 16-3-1), Tausonia pullulans (CCY 30-1-15) a Trichosporon asahii (CCY 30-19-1) byly sestaveny aktivitní křivky produkce polygalakturonáz a růstové křivky v průběhu kultivace (168 hodin). Kmen Galactomyces candidum CCY 16-3-2 byl vyhodnocen jako nejlepší producent termostabilních polygalakturonáz, které by bylo vhodné blíže charakterizovat. Výsledky screeningu poukazují na mnohdy výrazný vnitrodruhový rozdíl v produkci enzymatických aktivit, takže pro biotechnologické využití těchto enzymů je vždy nutné vybrat a charakterizovat přímo daný produkční kmen a nelze v tomto směru očekávat shodné chování ani přes jejich prokázanou příbuznost.
|
|
|
Random mutagenesis and selection of red yeast mutants capable to utilize particular waste substrates
Čačková, Katarína ; Breierová, Emília (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Carotenoids are naturally occurring pigments of plants also produced by microbes. The area of their application concerns mainly food industry; however, they are used in chemical, pharmaceutical, and cosmetics industry as well. Currently, the isolation of carotenoids from plants is markedly regulated by legislation, so the study of their production is greatly emphasised, where the microbiological, instead of the synthetic, production of carotenoids is being prioritized. This work was made as a comparative study of carotenogenic yeasts of the genes Rhodotorula, Sporobolomyces, and Cystofilobasidium. Their ability to use various waste substrates as a carbon and nitrogen source and source of other nutrition factors was tested. In this work, conditions of random mutagenesis were optimized. Particular yeast strains were also subjected to the effect of mutagen ethyl methanesulfonate (EMS) in order to increase the production of biomass and specific metabolites – carotenoids and other lipid-soluble substances. Random mutagenesis and mutant strain selection was performed using waste subtrates as glycerol, pasta and some pasta hydrolyzed by fungal extracellular enzymes. Subsequently, a control of specific DNA sequences in pigments overproducing mutants was analyzed by PCR/DGGE (denaturating gradient gel electrophoresis). Increased production of -carotene was achieved in a mutant of Sporobolomyces roseus strain growing on glycerol, pasta, and hydrolyzed pasta. Overproduction of carotenoids by mutant strain of Rhodotorula glutinis was observed in glucose medium only. Mutants of Cystofilobasidium capitatum exhibited a decrease of biomass production; on the other hand, the production of carotenoids increased especially in pasta medium hydrolyzed by enzyme preparative from Fusarium solani. In this work it was confirmed that using random mutagenesis strains capable to utilize waste substrates can be selected. In mutant strains increased carotenoids biosynthesis was observed, which enables effective use of cheap substrates and reduction of the negative effects of wastes on the environment.
|
|
|
Studium karotenogenních kvasinek v průběhu růstu pomocí pokročilých instrumentálních technik
Vaněk, Martin ; Breierová, Emília (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Tato práce se zabývá využitím pokročilých fluorescenčních technik při získávání poznatků o průběhu kultivace karotenogenních kvasinek. Zkoumá možnosti průtokové cytometrie při měření autofluorescence a kvantifikaci karotenoidů. Ukázalo se, že dokud jsou karotenoidy ukládány do membránových struktur, je metoda použitelná. Ovšem v průběhu stacionární fáze karotenogenní kvasinky vždy začnou ukládat karotenoidy i do lipidických granulí, a tehdy metoda selhává. Dále byly zkoumány možnosti průtokové cytometrie pro stanovení velikosti buněk a obsahu lipidů. Dokud buňky nehladoví, tedy není vyčerpán substrát v médiu, tak tato měření vysoce korelují s obsahem lipidů dle plynové chromatografie. Nutností je ovšem sestrojení kalibrace pro každý kvasničný druh zvlášť, aby byla vystižena specifika vnitrobuněčné stavby. Další zkoumanou metodou byla fluorescenční mikroskopie se schopností časově rozlišené detekce, umožňující ve vzorku pozorovat odlišné spécie téže sloučeniny, v závislosti na rozdílných prostředích, ve kterých se nachází. Pomocí této metody byly pozorovány a kvantifikovány změny buněčných lipidických struktur (membrán, lipidických granulí) a nalezeny souvislosti s přizpůsobováním se podmínkám prostředí. Zvyšování koncentrace karotenoidů a/nebo zvýšení rigidity membrán dochází tehdy, když buňka přechází z jednoho růstového a metabolického stádia do druhého a potřebuje chránit intracelulární obsah během takové změny.
|
|
|
Regulace produkce lipidů a lipidických metabolitů u kvasinek
Rapta, Marek ; Breierová, Emília (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
U oleogénnych kvasiniek dochádza za vhodných podmienok k nadprodukcii a následnej akumulácii lipidov a lipidických látok. Touto vlastnosťou sa vyznačujú aj červené kvasinky, ktoré okrem lipidov produkujú aj karotenoidy – prírodné pigmenty využívané v potravinár-stve a doplnkoch stravy. Práca bola zameraná na skríning produkčných vlastností kmeňov Cystofilobasidium capitatum, Rhodotorula glutinis, Sporobolomyces roseus a Sporobolomy-ces shibatanus. Ako zdroje uhlíka boli zvolené glukóza a glycerol ako odpadný produkt pri produkcii biopalív. Najlepšie produkčné vlastnosti sa prejavili pri kmeňoch Cystofilobasidium capitatum a Rhodotorula glutinis. Pri nich došlo k zvýšeniu akumulovaných lipidov za súčasnej produkcie vyšších koncentrácii karotenoidov. Kmene boli testované metódou FTIR spektroskopie, ktorá umožňuje vysokovýkonnú, nenáročnú a presnú analýzu.
|
|
|
Vliv složení kultivačního média na hmotnostní spektra kvasinek druhů Cryptococcus laurentii a Cryptococcus flavescens
Ledvina, Vojtěch ; Breierová, Emília (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Cryptococcus laurentii a Cryptococcus flavescens jsou nefermentující kvasinky tvořící extracelulární polysacharidovou kapsuli. Jedná se o saprofytické druhy, nicméně Cr. laurentii je znám i jako oportunní patogen u imunokomprimovaných jedinců. Dříve byl Cr. flavescens považován za synonymum Cr. laurentii, v současnosti je ale klasifikován jako samostatný druh náležící do fylogenetické skupiny I Cr. laurentii. V experimentální části bylo 28 kmenů druhů Cr. laurentii, Cr. flavescens a Cr. victoriae biotypizováno pomocí MALDI-TOF MS. Buňky byly kultivovány na třech různých médiích (Sabouraudův, YPD a bramborový agar) a proteiny byly extrahovány třemi metodami. Sledován byl vliv složení původního média, ze kterého byly kmeny přeočkovány, na kvalitu spekter, vhodnost jednotlivých metod pro různá média, dále zda složení média ovlivňuje kvalitu spekter a na závěr byly všechny kmeny porovnány s typovým kmenem Cr. laurentii CCY 17-3-2. Bylo zjištěno, že vliv původního substrátu nemá zásadní vliv na kvalitu spekter a stejně tak složení kultivačního média. Rozhodující je metoda přípravy vzorku. Nejkvalitnější spektra byla detekována při kultivaci na YPD agaru a promytí buněk ethanolem. Bramborový agar byl shledán nevhodným pro kultivaci kvasinek rodu Cryptococcus, protože při růstu buněk dochází ke značné produkci extracelulárních polysacharidů znesnadňujících extrakci proteinů. Všechny kmeny byly dále srovnány s typovým kmenem Cr. laurentii CCY 17-3-2 a byly vytvořeny MSP dendrogramy na základě podobnosti spekter. Při vzájemném srovnání všech kmenů byly kmeny úspěšně rozděleny na všech médiích do příslušných druhů. V závěru byly srovnány sekvence D1/D2 domén LSU genu vybraných kmenů a fylogenetický strom byl porovnán s MSP denrogramy.
|
|
|
Biotyping of Cryptococcus laurentii group using mass spectrometry
Jäger, Jakub ; Breierová, Emília (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Cryptococcus laurentii has been classically considered a saprophytic species, although several cases of human and animal infection have been already reported. This species is reported to be heterogenous. The taxonomy of yeast Cryptococcus laurentii was always highly ambiguous. The application of molecular biology and bioinformatic methods led to dividing of searched strains to two distinct phylogenetic groups, some varieties were recognized as species and the locution „Cryptococcus laurentii group“ was introduced. The taxonomy of this group is likely not definitive and with advancing knowledge will change. Our aim was the identification of individual species within this group based on matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight mass spectrometry (MALDI – TOF MS), which has recently been described as a rapid, reliable, cost-effective and powerful tool for analyzing of microorganisms, even on variety level. Generally, the yeasts of genus Cryptococcus form highly resistant polysaccharide capsules and produce large amount of extracellular polysaccharides, therefore belong to so called „difficult“ cases for biotyping. The experimental protocol has been optimized for MS analysis of this genus on the selected strains of Cr. neoformans, Cr. laurentii and Cr. magnus from the Culture Collection of Yeasts (CCY).Thirty-three strains, originally classified as Cryptococcus laurentii has been identified by chosen method. These strains were distributed into six different groups according their spectra similarities. It was selected at least one strain of each group, which was classified based on the sequence analysis of the D1/D2 domains of the LSU rRNA gene. This strain (with known sequence) became representative for its group. Type strain of Cryptococcus laurentii (CCY 17-3-2) belongs to the group I. Its MS spectrum of ribosomal proteins differ from mass spectra of all other biotyped species, even with strains identified as Cryptococcus laurentii was the similarity of the spectra low, which could be caused by identification of two different varieties. The group II is represented by Cryptococcus laurentii CCY 17-3-17. Except this strain, thirteen more strains belong to the group II. The group III represents Cryptococcus flavescens CCY 17-3-29. This group included 12 additional strains with almost identical mass spectra. Group IV included only one strain (CCY 17-3-13), which was identified as Cryptococcus carnescens based on gene sequence analysis. Similarly, one representative (CCY 17-3-5) has the group V. Strain CCY 17-3-5 was identified as Cryptococcus flavus. The last group VI of three members represents strain 17-3-35 identified as Bulleromyces albus. While Cr. laurentii and Cr. flavescens belong to phylogenetic group I and Cr. carnescens to the phylogenetic group II, four strains giving two types of different MS spectra and identified as Cr. flavus (1 strain) and Bulleromyces albus (3 strains) were excluded from „Cr. laurentii group.“
|
|
|
Extracelulární enzymové aktivity půdních kvasinek
Pavlatovská, Barbora ; Breierová, Emília (oponent) ; Stratilová, Eva (vedoucí práce)
Předložená práce se zabývá schopností kvasinek, izolovaných z půdy pod ovocnými stromy a z kontaminované půdy oblasti Pernek jihozápadního Slovenska, produkovat extracelulární enzymové aktivity. Celkem bylo screeningu podrobeno 68 kmenů kvasinek náležících k 45 různým druhům a testována byla schopnost produkce polygalakturonáz, lipáz, celuláz, proteáz, -glukosidáz, -amyláz a schopnost tvorby škrobu podobného polysacharidu. V rámci diplomové práce byla také provedena optimalizace metody pro stanovení chitinázové aktivity u kvasinek. Testována byla vhodnost celkem čtyř metod využívající jednak kultivaci na pevném tak v kapalném médiu. Zároveň byla prověřena vhodnost koloidního a nerozpustného chitinu pro kultivaci kvasinek. Jako nejvhodnější byla vyhodnocena kultivace kvasinek v kapalném médiu s koloidním chitinem a následná detekce chitinázové aktivity Ehrlichovým testem. Tato metoda byla posléze použita pro stanovení extracelulární chitinolytické aktivity všech 68 kmenů kvasinek. Více jak 75 % testovaných kvasinek vykazovalo alespoň jednu enzymatickou aktivitu a pouze deset kmenů bylo zcela enzymaticky neaktivních. Nejčastěji produkovanými enzymy byly extracelulární lipázy, proteázy a -glukosidázy a naopak méně častá byla produkce chitináz a celuláz. Širší spektrum enzymatických aktivit vykazovaly kvasinky izolované z půdy pod ovocnými stromy než kvasinky z kontaminovaných půd. Největší produkce extracelulárních enzymů byla pozorována u Aureobasidium pullulans, CCY 27-1-134, který vykazoval všechny testované aktivity, ale neprodukoval polysacharid podobný škrobu. Druhými největšími producenty byly druhy Cystofilobasidium macerans a Tausonia pullulans. Navíc tyto druhy vykazovaly vnitrodruhovou variabilitu v produkci lipáz a polygalakturonáz. Zástupci rodu Cryptococcus byli nejčastěji producenty lipáz, -amyláz a -glukosidáz, ale schopnost produkce jednotlivými kmeny se poměrně výrazně lišila. Pro všechny testované kmeny rodu Galactomyces byla stanovena produkce polygalakturonáz a všechny kmeny rodu Candida a Cyberlindnera produkovaly -glukosidázy. Pro všechny kmeny druhu Galactomyces candidum (CCY 16-3-2, 16-3-4, 16-3-6), Galactomyces pseudocandidus (CCY 16-3-1), Tausonia pullulans (CCY 30-1-15) a Trichosporon asahii (CCY 30-19-1) byly sestaveny aktivitní křivky produkce polygalakturonáz a růstové křivky v průběhu kultivace (168 hodin). Kmen Galactomyces candidum CCY 16-3-2 byl vyhodnocen jako nejlepší producent termostabilních polygalakturonáz, které by bylo vhodné blíže charakterizovat. Výsledky screeningu poukazují na mnohdy výrazný vnitrodruhový rozdíl v produkci enzymatických aktivit, takže pro biotechnologické využití těchto enzymů je vždy nutné vybrat a charakterizovat přímo daný produkční kmen a nelze v tomto směru očekávat shodné chování ani přes jejich prokázanou příbuznost.
|
|
|
Studium karotenogenních kvasinek v průběhu růstu pomocí pokročilých instrumentálních technik
Vaněk, Martin ; Breierová, Emília (oponent) ; Márová, Ivana (vedoucí práce)
Tato práce se zabývá využitím pokročilých fluorescenčních technik při získávání poznatků o průběhu kultivace karotenogenních kvasinek. Zkoumá možnosti průtokové cytometrie při měření autofluorescence a kvantifikaci karotenoidů. Ukázalo se, že dokud jsou karotenoidy ukládány do membránových struktur, je metoda použitelná. Ovšem v průběhu stacionární fáze karotenogenní kvasinky vždy začnou ukládat karotenoidy i do lipidických granulí, a tehdy metoda selhává. Dále byly zkoumány možnosti průtokové cytometrie pro stanovení velikosti buněk a obsahu lipidů. Dokud buňky nehladoví, tedy není vyčerpán substrát v médiu, tak tato měření vysoce korelují s obsahem lipidů dle plynové chromatografie. Nutností je ovšem sestrojení kalibrace pro každý kvasničný druh zvlášť, aby byla vystižena specifika vnitrobuněčné stavby. Další zkoumanou metodou byla fluorescenční mikroskopie se schopností časově rozlišené detekce, umožňující ve vzorku pozorovat odlišné spécie téže sloučeniny, v závislosti na rozdílných prostředích, ve kterých se nachází. Pomocí této metody byly pozorovány a kvantifikovány změny buněčných lipidických struktur (membrán, lipidických granulí) a nalezeny souvislosti s přizpůsobováním se podmínkám prostředí. Zvyšování koncentrace karotenoidů a/nebo zvýšení rigidity membrán dochází tehdy, když buňka přechází z jednoho růstového a metabolického stádia do druhého a potřebuje chránit intracelulární obsah během takové změny.
|
host ::
RSS.