|
|
Study of intermolecular interactions by isothermal titration calorimetry
Pšenáková, Katarína ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Alblová, Miroslava (oponent)
Kalorimetrické metódy sa využívajú na štúdium mechanizmov regulácie a riadenia biologických procesov na molekulárnej úrovni. Izotermálna titračná kalorimetria sa používa na sledovanie tepelnej výmeny pri molekulových interakciách v prostredí s konštantnou teplotou, využívaná je najmä pre jej priamy prístup merania termodynamických parametrov spojených s formáciou komplexov. Štandardne sa metódou ITC skúmajú biochemické interakcie, ako sú interakcie typu proteín - proteín, proteín - ligand alebo enzým - substrát. Cieľom tejto práce bolo (I) osvojiť si prácu s nano izotermálnym titračným kalorimetrom, (II) pripraviť DNA- väzbovú doménu ľudského transkripčného faktoru FOXO4 (FOXO4-DBD) a (III) preskúmať termodynamické aspekty interakcie medzi FOXO4-DBD a dvojvláknovej molekuly DNA (dsDNA) obsahujúcej špecifický väzbový motív. Proteín FOXO4 je jedným zo štyroch zástupcov "O" podskupiny forkhead transkripčných faktorov FOXO, ktoré hrajú významnú rolu v mnohých bunkových procesoch, vrátane onkogenézy, alebo ochrany pred stresom a starnutím. Forkhead doména sa viaže na sekvenciu DNA obsahujúcu väzbový motív 5'-(A/C)AA(C/T)A-3' so stechiometriou 1:1. Výsledky tejto práce potvrdili, že DNA-väzbová doména FOXO4 viaže študovanú dsDNA s disociačnou konštantou KD = 3,58 · 10−7 mol·dm−3 . Okrem väzbovej afinity...
|
|
|
Molekulární mechanismus regulace funkce neutrální trehalasy Nth1
Alblová, Miroslava
Enzym neutrální trehalasa (Nth1, EC 3.2.1.28), pocházející z kvasinek rodu Saccharomyces cerevisiae, pomáhá těmto organismům přežít v nepříznivých životních podmínkách. Nth1 hydrolyticky štěpí zásobní a ochranný disacharid trehalosu za vzniku dvou molekul glukosy. Aktivita enzymu Nth1 je regulována prostřednictvím fosforylace cAMP-dependentní proteinkinasou (PKA), následnou vazbou kvasničného proteinu 14-3-3 (Bmh1) a pomocí kationtů Ca2+ , které se váží na Ca-vazebnou doménu. Tato doména se nachází na N-konci Nth1 a obsahuje tzv. EF-hand motiv (D114 TDKNYQITIED125 ), který je konzervovaný mezi velkým množstvím Ca-vazebných proteinů. Hlavním cílem tohoto projektu bylo objasnění molekulární a strukturní podstaty mechanismu regulace aktivity Nth1 prostřednictvím vazby kationtů Ca2+ a proteinu Bmh1. Dalšími cíli bylo vyřešení struktury samotné Nth1 a jejího komplexu s Bmh1. Pro výzkum úlohy kationtů Ca2+ v regulaci aktivity Nth1 bylo připraveno dvanáct mutantních forem Nth1 s cílenými bodovými mutacemi v oblasti tzv. EF-hand motivu a jeho blízkém okolí a následně byla stanovena jejich aktivita v závislosti na přítomnosti Bmh1 a/nebo kationtů Ca2+ . Tvorba stabilních komplexů fosforylované pNth1 (včetně mutantních forem) s proteinem Bmh1 byla potvrzena pomocí nativní polyakrylamidové gelové...
|
|
|
Molekulární mechanismus regulace funkce neutrální trehalasy Nth1
Alblová, Miroslava
Enzym neutrální trehalasa (Nth1, EC 3.2.1.28), pocházející z kvasinek rodu Saccharomyces cerevisiae, pomáhá těmto organismům přežít v nepříznivých životních podmínkách. Nth1 hydrolyticky štěpí zásobní a ochranný disacharid trehalosu za vzniku dvou molekul glukosy. Aktivita enzymu Nth1 je regulována prostřednictvím fosforylace cAMP-dependentní proteinkinasou (PKA), následnou vazbou kvasničného proteinu 14-3-3 (Bmh1) a pomocí kationtů Ca2+ , které se váží na Ca-vazebnou doménu. Tato doména se nachází na N-konci Nth1 a obsahuje tzv. EF-hand motiv (D114 TDKNYQITIED125 ), který je konzervovaný mezi velkým množstvím Ca-vazebných proteinů. Hlavním cílem tohoto projektu bylo objasnění molekulární a strukturní podstaty mechanismu regulace aktivity Nth1 prostřednictvím vazby kationtů Ca2+ a proteinu Bmh1. Dalšími cíli bylo vyřešení struktury samotné Nth1 a jejího komplexu s Bmh1. Pro výzkum úlohy kationtů Ca2+ v regulaci aktivity Nth1 bylo připraveno dvanáct mutantních forem Nth1 s cílenými bodovými mutacemi v oblasti tzv. EF-hand motivu a jeho blízkém okolí a následně byla stanovena jejich aktivita v závislosti na přítomnosti Bmh1 a/nebo kationtů Ca2+ . Tvorba stabilních komplexů fosforylované pNth1 (včetně mutantních forem) s proteinem Bmh1 byla potvrzena pomocí nativní polyakrylamidové gelové...
|
|
|
Studium post translačních modifikací fosducinu
Šimůnek, Jiří ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Alblová, Miroslava (oponent)
Předkládaná diplomová práce se zabývá studiem úlohy posttranslačních modifikací fosducinu na jeho interakci s proteinem 14-3-3 a dále posouzení vlivu tvorby komplexu na tyto modifikace. Fosducin je 33kDa protein nacházející se ve fotoreceptorových buňkách sítnice, ale také v jiných tkáních. Přes mnohé experimenty jsou však jeho fyziologické funkce stále řešeným tématem. Spekuluje se o jeho vlivu při regulaci signální dráhy oční sítnice, krevního tlaku a exprese G-proteinů. Funkce fosducinu je regulována proteinem 14-3-3, jenž hraje roli v mnohých biochemických procesech. Tvorba komplexu mezi proteinem 14-3-3 a fosducinem vyžaduje fosforylaci dvou serinových zbytků v N-terminální doméně molekuly fosducinu. Úloha vazby proteinu 14-3-3 v regulaci funkce fosducinu je ovšem stále nejasná. V rámci této diplomové práce byly exprimovány proteiny 14-3-3ζ∆C a fosducin (s mutací Q52K) a úspěšně purifikovány. Ke studiu vlivu tvorby komplexu na posttranslační modifikace fosducinu bylo využito limitované proteolýzy a defosforylace. Experimenty ukázaly, že tvorba komplexu způsobuje významné zpomalení defosforylace Ser-54 i Ser-73 a proteolytické degradace, což indikuje protektivní funkci vazby proteinu 14-3-3ζ∆C. Úloha obou 14-3-3ζ∆C vazebných motivů obsahujících Ser-54 a Ser-73 pro interakci fosducinu s...
|
|
|
Studium interakce fosducinu s proteinem 14-3-3
Šimůnek, Jiří ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Alblová, Miroslava (oponent)
Tato bakalářská práce se zabývá interakcí proteinu 14-3-3 a fosducinu, které se podílejí na regulaci přenosu signálu v oční sítnici obratlovců. Tento přenos a zároveň i zesílení signálu jsou zprostředkovány G-proteinovou signální dráhou. Přenos signálu v závislosti na intenzitě světla je regulován dalšími proteiny včetně fosducinu. Fosducin je 33kDa protein, který je exprimován v mnoha tkáních, především ve fotoreceptorových buňkách oční sítnice. Jeho regulační funkce spočívá v inhibici funkce G-proteinu (transducinu). Při přenosu signálu je nutný rozpad transducinu Gtαβγ na podjednotku α (Gtα) a komplex βγ (Gtβγ). Pro opětovnou funkci je nutná reasociace heterotrimeru Gtαβγ, čemuž zabraňuje fosducin, a to vazbou na komplex Gtβγ. Nepřítomnost kompletního transducinu má za následek přerušení signální dráhy a snížení přenosu signálu. Při slabém osvětlení je nutné přenášený signál zesílit, a proto je v sítnici adaptované na tmu fosducin fosforylován, což rozruší jeho vazbu s Gtβγ podjednotkou a obnoví funkci transducinu. Fosforylovaný fosducin je vázán proteinem 14-3-3. Úloha proteinu 14-3-3 v regulaci funkce fosducinu je však stále nejasná. Protein 14-3-3 je 28 kDa protein, který je exprimován ve všech eukaryotických buňkách. Jedná se o protein s rigidní strukturou, který váže a reguluje funkce více...
|
|
|
Study of intermolecular interactions by isothermal titration calorimetry
Pšenáková, Katarína ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Alblová, Miroslava (oponent)
Kalorimetrické metódy sa využívajú na štúdium mechanizmov regulácie a riadenia biologických procesov na molekulárnej úrovni. Izotermálna titračná kalorimetria sa používa na sledovanie tepelnej výmeny pri molekulových interakciách v prostredí s konštantnou teplotou, využívaná je najmä pre jej priamy prístup merania termodynamických parametrov spojených s formáciou komplexov. Štandardne sa metódou ITC skúmajú biochemické interakcie, ako sú interakcie typu proteín - proteín, proteín - ligand alebo enzým - substrát. Cieľom tejto práce bolo (I) osvojiť si prácu s nano izotermálnym titračným kalorimetrom, (II) pripraviť DNA- väzbovú doménu ľudského transkripčného faktoru FOXO4 (FOXO4-DBD) a (III) preskúmať termodynamické aspekty interakcie medzi FOXO4-DBD a dvojvláknovej molekuly DNA (dsDNA) obsahujúcej špecifický väzbový motív. Proteín FOXO4 je jedným zo štyroch zástupcov "O" podskupiny forkhead transkripčných faktorov FOXO, ktoré hrajú významnú rolu v mnohých bunkových procesoch, vrátane onkogenézy, alebo ochrany pred stresom a starnutím. Forkhead doména sa viaže na sekvenciu DNA obsahujúcu väzbový motív 5'-(A/C)AA(C/T)A-3' so stechiometriou 1:1. Výsledky tejto práce potvrdili, že DNA-väzbová doména FOXO4 viaže študovanú dsDNA s disociačnou konštantou KD = 3,58 · 10−7 mol·dm−3 . Okrem väzbovej afinity...
|
host ::
RSS.