|
|
Izolace DNA z probiotických druhů baktérií mléčného kvašení v potravinových doplňcích
Tvrdíková, Jana ; Vojtíšková, Marie (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
V této práci byly testovány magnetické nosiče funkcionalizované streptavidinem při selektivní izolaci DNA. Metoda selektivní izolace DNA byla testována s využitím DNA probiotického kmene Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CCDM 211/06. Na nosiče s navázaným streptavidinem byl imobilizován biotinylovaný oligonukleotid a využit jako DNA sonda pro izolaci komplementárního řetězce DNA pomocí DNA/DNA hybridizace. Jako DNA sonda byl testován primer R 5´ bio a biotinylovaný denaturovaný PCR produkt specifický pro druh Lb. paracasei. Byly optimalizovány následující experimentální podmínky selektivní izolace DNA: teplota a doba hybridizace, množství DNA, eluce DNA z mikročástic. Izolace DNA byla ověřena pomocí PCR s rodově specifickými primery. Byl amplifikován rodově specifický PCR produkt o velikosti 250 bp, který byl prokázán pomocí gelové elektroforézy na agaróze. Použitý postup byl úspěšně použit při selektivní izolaci DNA Lactobacillus z komplexního vzorku doplňku stravy (BIFI pangamin).
|
|
|
Mikroextrakce DNA z rostlinných tkání zeleniny
Cesnak, Filip ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
Diplomová práca bola zameraná na porovnanie dvoch mikroizolačných metód DNA s využitím magnetických častíc z potravín rastlinného pôvodu. Vzorky mali rôznorodé, komplexné matrice a boli v surovom (brokolica, list z jahodníka obecného) alebo technologicky opracovanom stave (jahodový džem). Prvá metóda využíva na manipuláciu magnetických častíc magnetický separátor a slúžila ako štandart pri porovnaní. Druhá metóda využíva paramagnetickú ihlu, ktorej výhodou by mala byť možnosť izolácie DNA vo vyššej kvalite bez výraznej kontaminácie polyfenolickými látkami či proteínmi. Vhodnosť metódy bola vyhodnotená štatistickým porovnaním výsledkov získaných obidvomi metódami. Kvalita DNA bola posúdená testovaním amplifikovatelnosti izolovanej DNA pomocou PCR. Amplifikované produkty boli vizualizované na agarózovom gély pomocou elektroforézy.
|
|
|
Identifikace bakterií mléčného kvašení v kysaných mléčných výrobcích s využitím amplifikačních metod
Tycová, Martina ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Polymerázová řetěžová reakce (PCR) je molekulární diagnostická metoda, která umožňuje identifikaci bakterií mléčného kvašení používaných v potravinářském průmyslu. V této práci byla použita PCR pro identifikaci bakterií druhu Streptococcus thermophilus v 10-ti náhodně vybraných komerčně dostupných kysaných mléčných výrobcích a pro identifikaci druhu Streptococcus thermophilus v 25 lyofilizátech kmenů získaných ze Sbírky mlékařských kultur Laktoflóra (CCDM, Tábor, CZ). Druhově specifické PCR primery byly cíleně vybrány z oblastí 16S rDNA. PCR produkty (968bp) byly detekovány použitím elektroforézy na 1,2 % agarózovém gelu. Bakteriální DNA byla izolována z hrubých lyzátů buněk magnetickými nosiči P(HEMA-co-GMA) obsahujícími karboxylové skupiny. DNA byla vratně navázána na jejich povrch v přítomnosti vysoce koncentrovaného polyethylenglykolu (PEG 6000) a chloridu sodného. Metoda fenolové extrakce DNA byla použita jako kontrolní. Pomocí metody PCR byly identifikovány bakterie druhu Streptococcus thermophilus ve v všech analyzovaných vzorcích.
|
|
|
Separace a purifikace nukleových kyselin s využitím magnetických mikročástic
Vlachová, Jana ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Použití magnetických mikročástic při izolaci nukleových kyselin z reálných vzorků je moderní a rychlý separační postup, který je vhodný pro použití v běžné laboratorní praxi. Cílem bakalářské práce byla izolace DNA z mléčného výrobku (Activia sladká bílá) v kvalitě vhodné pro PCR. Izolace DNA byla provedena magnetickými mikročásticemi P(HEMA co GMA) v prostředí 2 M NaCl a 16% PEG 6000 nebo 8% PEG 6000. Pomocí PCR byla prokázána přítomnost DNA probiotických bakterií rodu Lactobacillus a Bifidobacterium deklarovaných výrobcem.
|
|
|
Příprava a purifikace plasmidových DNA
Němeček, Milan ; Španová, Alena (oponent) ; Rittich, Bohuslav (vedoucí práce)
S rozvojem terapeutických metod v lékařství, jako jsou DNA vakcíny a genová terapie, se zvyšuje poptávka po nových postupech izolace a purifikace vysoce čisté plazmidové DNA. Nejčastěji využívanými metodami purifikace plazmidové DNA jsou metody chromatografické. V experimentální části byla provedena izolace plazmidové DNA pUC 19 metodou alkalické lýze. A následně byla provedena purifikace plazmidové DNA agarózovou gelovou elektroforézou a kapalinovou chromatografií.
|
|
|
Identifikace bakterií druhu Lactobacillus acidophilus v probiotických výrobcích
Sznapková, Veronika ; Trachtová, Štěpánka (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Probiotické bakterie mléčného kvašení (BMK) jsou významnou součastí především fermentovaných mléčných výrobků, farmaceutických preparátů a doplňků stravy. V současné době se k rychlé a přesné identifikaci bakterií využívají molekulárně biologické metody založené na amplifikaci DNA. Cílem diplomové práce bylo nekultivačními postupy identifikovat bakterie rodu Lactobacillus a druhu Lactobacillus acidophilus v komplexních matricích celkem sedmi různých doplňků stravy. Celková DNA byla izolována z hrubých lyzátů buněk ve výrobcích s využitím magnetického nosiče P(HEMA-co-GMA). Amplifikovatelnost DNA byla ověřena v PCR s primery specifickými pro doménu Bacteria. Izolovaná DNA byla dále amplifikována s použitím primerů specifických pro rod Lactobacillus a druh Lactobacillus acidophilus s cílem prokázat přítomnost tohoto bakteriálního rodu a druhu, jež jsou deklarovány výrobci. Výsledky identifikace bakterií získané pomocí PCR byly porovnány s údaji deklarovanými výrobci.
|
|
|
Analýza mikrobiálního složení vybraných probiotických výrobků metodou PCR-HRM
Tomanová, Barbora ; Španová, Alena (oponent) ; Trachtová, Štěpánka (vedoucí práce)
Práce byla zaměřena na průkaz probiotických bakterií ve čtyřech různých probiotických výrobcích (probiotický krém, probiotické tampóny, orální probiotikum a sójový nápoj s probiotiky). Byla ověřena viabilita bakterií obsažených ve výrobcích. Z komplexních matric výrobků byla izolována DNA v kvalitě vhodné pro metodu PCR s následnou identifikací deklarovaných bakteriálních rodů a druhů. K amplifikaci pomocí konvenční PCR a PCR v reálném čase byly použity rodově a druhově specifické primery. Ve výrobcích byly prokázány bakterie rodu Lactobacillus a Bacillus a bakteriální druhy Lactobacillus pentosus, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus fermentum a Lactobacillus gasseri. Následně byla testována možnost rozlišení směsi bakteriálních druhů v DNA izolované z probiotického tampónu metodou PCR-HRM. K tomu bylo testováno pět sad primerů. Jako nejvhodnější pro rozlišení byly vyhodnoceny 2 sady primerů (primery P1V1, P2V1 a V1F-HRM, V1R-HRM).
|
|
|
Magnetické nosiče a jejich praktické využití
Chlopková, Barbora ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
Teoretická část shrnuje dosavadní poznatky pro praktické využití magnetických nosičů v molekulární diagnostice. Zahrnuje jak již používané metody, tak i metody s potenciálním využitím do budoucna. V experimentální části bylo testováno využití magnetických nosičů pro izolaci DNA z mléčného výrobku a bakteriální kultury. Bylo potvrzeno, že magnetickými nosiči byla izolována DNA v kvalitě a množství vhodném pro provedení polymerázové řetězové reakce.
|
|
|
Izolace, identifikace a charakterizace mikroflóry vína a vybraných potravin
Šuranská, Hana ; Španová, Alena (oponent) ; Jarošová, Alžběta (oponent) ; Omelková, Jiřina (vedoucí práce)
Předložená disertační práce se zabývá mikrobiologií vína a ručně vyráběných sýrů. První část práce je zaměřena na identifikaci kvasinkové mikroflóry izolované z bobulí a moštů během kvasného procesu výroby moravských vín. Jako matrice byly voleny odrůdy bílého (Sauvignon) a červeného (Rulandské modré) vína pocházející z integrované a ekologicky ošetřené vinice. Čisté kultury byly identifikovány molekulární metodou ITS-PCR-RFLP (amplifikující oblast vnitřního přepisovaného mezerníku ITS: ITS1, ITS2 a 5,8S rDNA) za použití tří až sedmi restrikčních endonukleáz a následně sekvenací ITS oblasti u vybraných izolátů. Z celkového počtu 524 izolátů bylo identifikováno 14 druhů řadící se do šesti rodů. Na začátku se fermentačního procesu účastnily nesaccharomycetní druhy s převahou druhu Hanseniaspora uvarum, v pozdějších fázích, díky rostoucí koncentraci alkoholu, byl predominantní druh Saccharomyces cerevisiae. Cílem práce bylo dále zavést postup aplikace selektovaných kmenů S. cerevisiae při řízené velkoobjemové výrobě vína. Předpokladem selekce byla v první řadě kmenová identifikace druhu S. cerevisiae. Rod Saccharomyces byl od ostatních nesaccharomycetních druhů odlišen metodou ITS-PCR-RFLP. Za účelem druhového a následně i kmenového odlišení byla aplikována řada dalších molekulárních metod zahrnujících PCR-fingerprinting (rep- a RAPD-PCR), druhově-specifické primery (multiplexní a touchdownovou PCR), LSU-DGGE a amplifikaci delta oblastí rDNA druhu S. cerevisiae. Druhově specifické primery odlišily některé druhy komplexu Saccharomyces sensu stricto, amplifikace delta sekvencí za použití primerů 1-2 se ukázala být vhodným nástrojem k odlišení kmenů druhu S. cerevisiae. Celkově bylo izolováno 120 kmenů rodu Saccharomyces, z toho bylo identifikováno 45 kmenů odlišných. Na základě dobrých technologických vlastností (osmotolerance, alkoholová tolerance, nízká produkce H2S aj.) byl vybrán autochtonní kmen S. cerevisiae 1-09 izolovaný z bobulí. Tento kmen byl testován při velkoobjemové fermentaci. Na základě chemické a senzorické analýzy vín byla na závěr posouzena vhodnost kmene pro výrobu vína. Vína připravená inokulací moštu autochtonním kmenem S. cerevisiae 1-09 se výrazně nelišila od vín, která byla připravena inokulací moštu komerčně dostupným kmenem. Další část práce je zaměřena na izolaci, kvantifikaci a identifikaci kvasinek z ručně vyráběných sýrů a jejich meziproduktů pocházejících ze zemí západního Balkánu. Izolované druhy byly identifikovány metodou ITS-PCR-RFLP, sekvenací, fyziologickými testy. Mezi dvaceti identifikovanými druhy byly D. hansenii, C. zeylanoides a Y. lipolytica druhy dominantními. Za účelem přímé detekce komplexního mikrobiálního systému zahrnujícího kvasinky a plísně byly aplikovány metody přímé analýzy DNA. Nově zavedená kultivačně nezávislá metoda založená na konstrukci knihovny z metagenomové DNA (ITS genomová knihovna spojená s restrikční analýzou) byla srovnána s kultivačně nezávislou LSU-DGGE a taktéž s kultivačně závislou ITS-PCR-RFLP. Odlišnosti mezi metodami byly potvrzeny korelační analýzou a stanovenými indexy biodiverzity a dominance jednotlivých druhů. Tato studie, založená na analýze sekvencí DNA obdržené přímo ze vzorků, vrhá nový pohled na mikrobiální diverzitu a může tak otevírat nové perspektivy přímé komplexní analýzy kvasinek a plísní nejen z potravinových matric, ale i jiných přirozených prostředí.
|
|
|
Rekombinantní probiotika
Surá, Tereza ; Rittich, Bohuslav (oponent) ; Španová, Alena (vedoucí práce)
V teoretické části se pojednává o současném stavu a výzkumu rekombinantních probiotik, jejich využitelnosti v potravinářství a zdravotnictví. Dále se zabývá jejich příznivými účinky na zdraví jedince. Experimentální část je zaměřena na identifikaci určitého bakteriálního kmene v probiotických doplňcích stravy. Z těchto výrobků byla izolována DNA pomocí magnetických mikročástic a následně analyzována pomocí polymerázové řetězové reakce.
|
host ::
RSS.